Un ensayo de inmunofluorescencia para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos

Resumen

Fuente: Aulas, A. et al., Métodos para clasificar focos citoplasmáticos como gránulos de estrés en mamíferos.J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un ensayo para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos, que consisten en ARNm, proteínas de unión a ARN (RBP) y varias otras proteínas.

Protocolo

1. Preparación de la célula

1. Agregue cubreobjetos esterilizados en autoclave a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos, como se indica en la Figura 1A; esto se puede hacer usando una pipeta Pasteur estéril conectada a una aspiradora para recoger cada cubreobjetos. Golpee suavemente el cubreobjetos en el costado del pocillo para liberar la succión, permitiendo que el cubreobjetos caiga en el pozo.
2. Placa 1 x 10^{5 células} de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por pocillo a un volumen final de 500 μL de medio. Mueva la placa de lado a lado y de arriba a abajo varias veces para asegurarse de que las celdas se distribuyan uniformemente.
3. Presione suavemente los cubreobjetos hacia abajo con una punta limpia P1000 para asegurarse de que el cubreobjetos esté en el fondo del pozo y que no haya burbujas debajo del cubreobjetos.

>2. Células estresadas

1. Al día siguiente, revise visualmente la placa para asegurarse de que las células estén dispersas y confluentes uniformemente a través del cubreobjetos, ya que las variaciones entre las muestras pueden afectar negativamente la reproducibilidad de los resultados. Utilice un objetivo 10X en un microscopio de cultivo de tejidos invertido.
2. Precaliente el medio a 37 °C. Evite aplicar medios fríos o calientes a las celdas, ya que estos causan choque frío o choque térmico, respectivamente.
3. Diluir los medicamentos en medios precalentados. Para cada concentración diferente del medicamento, prepare 2 pocillos que contengan 500 μL de medio. Prepare 500 μL adicionales para permitir la pérdida durante el pipeteo. Alícuota 4 tubos, cada uno con 1,5 mL.
   1. Para el arsenito de sodio: a cada pocillo que contenga 500 μL, añadir 1,5 μL de arsenito de sodio 100 mM (concentración final: 100 μM) o añadir 0,75 μL de arsenito de sodio 100 mM (concentración final: 50 μM).
   2. Para la vinorelbina: a cada pocillo que contenga 500 μL, añadir 22,5 μL de vinorelbina de 10 mM (concentración final: 150 μM) o añadir 18,75 μL de vinorelbina de 10 mM (concentración final: 100 μM).
      nota: El arsenito de sodio es un inductor de gránulos de estrés bien caracterizado y comúnmente utilizado y, por lo tanto, se usa clásicamente como control positivo.
4. Retire y deseche los medios de los pocillos B1 - 4 y C1 - 4. Agregue el medio con los medicamentos y espere 60 minutos (Figura 1A).
   1. Agregue 500 μL de medio con 100 μM de arsenito de sodio a los pocillos B1 y B2. Agregue 500 μL de medio con 50 μM de arsenito de sodio a los pocillos B3 y B4.
   2. Añadir 500 μL de medio con 150 μM de vinorelbina a los pocillos C1 y C2. Añadir 500 μL de medio con 125 μM de vinorelbina a los pocillos C3 y C4.
5. 30 minutos antes de la fijación, tratar los pocillos de la columna 2 con 5 μL de cicloheximida (1 mg/mL de caldo) y los pocillos de la columna 4 con 2 μL de puromicina (1,25 mg/mL de caldo). Agite suavemente la placa para mezclar antes de volver a colocarla en la incubadora a 37 °C.

>3. Fijación celular e inmunofluorescencia

NOTA: Antes del experimento, asegúrese de que el metanol se enfríe a -20 °C. Prepare tampones, incluyendo solución salina tamponada con fosfato (PBS), 5% de suero normal de caballo (NHS) en PBS y 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.

1. Deseche los medios y lave los pocillos que contienen cubreobjetos con PBS. Dependiendo de los medicamentos utilizados, puede ser importante descartar adecuadamente los medicamentos que contienen medios; Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener instrucciones específicas. Para lavar de manera eficiente, llene una botella exprimible con PBS, corte la punta para permitir un flujo suave en lugar de un chorro apretado, y use esto para agregar PBS a cada pozo después de aspirar el PBS original.
2. Fije las celdas usando ~ 250 μL de PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, RT bajo agitación suave. Cubra completamente la parte superior del cubreobjetos con PFA; 250 μL deberían ser suficientes, pero si no, agregue más. Evite siempre pipetear directamente sobre los cubreobjetos, ya que algunas células (o tratamientos de estrés de las células) pueden alterar la adhesión, y la fuerza del pipeteo puede desplazar las células.
3. Retire el PFA y deséchelo correctamente. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener detalles sobre cómo desechar correctamente el paraformaldehído.
4. Añadir ~250 μL de metanol (-20 °C) e incubar durante 5 min a RT bajo un suave balanceo; esto permeabiliza y aplana las células.
5. Retire y deseche el metanol y bloquee las celdas aplicando ~ 250 μL de NHS al 5% durante 1 h a RT durante la noche, O/N, a 4 °C. Comuníquese con la oficina de seguridad ambiental local para obtener detalles sobre cómo desechar correctamente el metanol.
6. En el caso de los anticuerpos primarios, diluir los anticuerpos en un 5% NHS.
   nota: El uso de múltiples marcadores de SG es clave para confirmar si los gránulos observados son SG de buena fe. El número de marcadores SG que se pueden utilizar depende de los filtros disponibles en el microscopio. Si se dispone de conjuntos de filtros verdes, rojos y rojos lejanos estándar, utilice G3BP1, eIF4G y eIF3b en una dilución de 1/250.
   1. Para este experimento (12 cubreobjetos de 250 μL cada uno-Total: 3 mL de 5% de NHS), agregue 12 μL de cada uno de los siguientes: anti-G3BP1, anti-eIF3b y anti-eIF4G. Incubar los anticuerpos primarios mediante agitación suave durante al menos 1 h a RT o O/N a 4 °C.
7. Lave los pocillos 3 veces con PBS e incube cada lavado durante 5 minutos.
8. En el caso de los anticuerpos secundarios, diluir todos los anticuerpos secundarios (dilución 1/250) y el colorante de Hoechst (dilución 1/1.000) en NHS al 5%.
   1. Para este experimento (12 cubreobjetos de 250 μL cada uno-Total: 3 mL de 5% de NHS), agregue 12 μL de cada uno de los siguientes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit y Cy5-Goat (una dilución de 1/250 de cada uno) y agregue 3 μL de tinte Hoechst.
   2. Incubar los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios durante 1 h en RT. Durante este y los siguientes pasos, proteja las muestras de la luz cubriendo la placa con una caja o colocando papel de aluminio sobre la parte superior de la placa de cultivo de tejidos.
9. Lave los pocillos tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
10. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio etiquetados utilizando un medio de montaje. Calentar el medio de montaje en un bloque térmico a 37 °C durante 10 min; Esto disminuye la viscosidad y facilita la pipeta. Con una punta P200 cortada, pipetee 25 μL de medio de montaje por cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio; En un portaobjetos de vidrio pueden caber de 4 a 8 cubreobjetos, suponiendo que la platina del microscopio lo permita. Con pinzas finas, transfiera el cubreobjetos del pocillo al portaobjetos, asegurándose de colocar el lado de la celda hacia abajo en el medio de montaje. Con una punta P200 limpia, presione el cubreobjetos hacia abajo.
11. Una vez que se hayan montado todos los cubreobjetos, utilice un pañuelo de laboratorio doblado para limpiar el exceso de medio de montaje presionando el papel de laboratorio muy firmemente sobre el portaobjetos. Use un frasco exprimible que contenga H₂O para eliminar el exceso de medio de montaje y luego repita el secado con papel de laboratorio doblado para eliminar el agua.

Resultados

Figura 1: Diagramas experimentales. (A) Semillas de células en cubreobjetos previamente colocados en una placa de 24 pocillos, como se indica. Trate las filas A y B durante 60 min con SA o VRB utilizando la concentración en μM como se indica. Después de 60 minutos, agregue CHX (concentración final: 20 μg/mL para la columna 2) o puro (20 μg/mL de puromicina para la columna 4) al medio...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema operativo U-2	ATCC	ATCC®HTB-96™	- comúnmente escrito como "U2OS" - cultivo a 37 °C con un 5% de CO2 en un 10% de FBS/DMEM
Modificación de Dulbecco del medio del águila	Corning	10-013-CV	- abreviado DMEM - contiene 4,5 g/L de glucosa, piruvato y rojo de fenol - suplementado con 10% de FBS, 10 mM de HEPES y penicilina/steptomicina - Precalentar la dilución del fármaco (s) anterior - Precalentar la dilución de medicamentos anteriores
Suero Fetal Bovino	sigma	F2442-500ml	- abreviado FBS - Se utiliza para complementar los medios de comunicación
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080	- Se utiliza para complementar los medios de comunicación
Penicilina Estreptomicina	sigma	P0781-100ml	- Se utiliza para complementar los medios de comunicación
Placa de 24 pocillos	Coprotagonista	3524
Tejidos de laboratorio	CIENCIA KIMTECH	34120	- Comúnmente llamados "toallitas kim"
Cubreobjetos para el crecimiento Cubreobjetos	Fisher Científico	Teléfono 12-545-82	- Esterilizado en autoclave antes de su uso - Mantener estéril en la campana de cultivo de tejidos
(meta)arsenito de sodio ≥90%	sigma	S7400-100G	- comúnmente llamado arsenito de sodio y abreviado SA - disolución en agua a una concentración de 1 M, luego diluida a 100 μM como material de trabajo
Vinorelbine	TSZ CHEM	RS055	- abreviado VRB - disolver en agua hasta 10 mM
Puromicina	sigma	P9620	- Se utiliza para evaluar el nivel de traducción (ribopuromicilación) - se utiliza para evaluar la conexión de SG con la traducción activa - diluir en agua hasta 10 mg/mL
Hidrato de diclorhidrato de emetino	sigma	E2375	- Se utiliza en combinación con puro para evaluar el nivel general de traducción - se utiliza para evaluar la conexión de SG con la traducción activa - diluir en agua hasta 10 mg/mL
cicloheximida	sigma	C4859	- abreviado CHX - se utiliza para evaluar la conexión de SG con la traducción activa - diluir en agua hasta 10 mg/mL
Solución salina tamponada con fosfato	Lonza / VWR	95042-486	- abreviado PBS - Tampón de lavado para inmunofluorescencia
Grado reactivo de paraformaldehído, cristalino	sigma	P6148-500G	- prepare una solución al 4% en PBS caliente en la campana extractora, revuelva hasta que se disuelva - las alícuotas pueden almacenarse a -20 °C durante varios meses - peligroso, use ventilación - Desechar en residuos especiales
Metanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- preenfriado a -20 °C antes de su uso - Desechar en residuos especiales
Suero de Caballo Normal	Thermo Fisher Scientific	31874	- abreviado NHS - diluir al 5% en PBS - agregue azida de sodio para almacenar a 4 ° C - Solución bloqueante para inmunofluorescencia
Etanol, puro, 200 grados (100%),USP, KOPTEC	Laboratorios de descontaminación / VWR	89125-188	- diluir al 70% con agua
Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus de Fisherbrand	Marca Pescadora	Teléfono 12-550-15
Anticuerpo anti G3BP1 de ratón (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- almacenar a 4 °C - Usar en dilución 1/100
Anticuerpo anti eIF4G de conejo (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- almacenar a 4 °C - Dilución 1/250
Anticuerpo anti eIF3η (N-20) de cabra	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η también se conoce como eIF3b - almacenar a 4 °C - Dilución 1/250
Cy2 AffiniPure Burro Anti-Ratón IgG (H+L)	Investigación inmunológica de Jackson	715-225-150	- reconstituir en agua según las instrucciones del fabricante y luego almacenar a 4 °C - Dilución 1/250
Cy3 AffiniPure Burro Anti-Conejo IgG (H+L)	Investigación inmunológica de Jackson	711-165-152	- reconstituir en agua según las instrucciones del fabricante y luego almacenar a 4 °C - Dilución 1/2500
Cy5 AffiniPure Burro Anti-Cabra IgG (H+L)	Investigación inmunológica de Jackson	705-175-147	- reconstituir en agua según las instrucciones del fabricante y luego almacenar a 4 °C - Dilución 1/250
Solución Hoechst 33258	sigma	94403-1ML	- incubar con anticuerpos secundarios-solución madre 0,5 mg/mL en dH20, proteger de la luz- Almacenar a 4 °C
20 x Búfer SSC	Termo pescador Ambion	AM9763	- diluir a 2X SSC usando agua libre de RNasa (tratada con DEPC)- almacenar a temperatura ambiente- tampón de lavado para FISH
Medios de montaje deslizantes	Hecho en casa	/	- mezclar 5 g de poli(alcohol vinílico) "soluble en frío" en 20 ml de PBS- mezclar por sonicación, seguido de agitación durante la noche a RT- Añadir 5 ml de glicerol y 0,2 ml de azida sódica al 20 %, y agitar durante 16 h a RT- centrifugación a 20.000 g durante 20 min, desechar el líquido viscoso alícuota de pellets grandes, almacenamiento a largo plazo a -20 °C, 1 semana a 4 °C
Parafilm "M"	sigma	P7793-1EA	- Generalmente conocido como "parafilm"
Poli(alcohol vinílico)	sigma	P-8136-250G	- Reactivo para hacer vinol
glicerol	sigma	G5516-100ML	- Reactivo para hacer vinol
Azida de sodio	Fisher Científico	S2002-5G	- Conservante para solución de bloqueo y vinol - Diluir al 20 % en agua