Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación del ensayo
- Reúna, prepare y organice los materiales especificados para el procedimiento (consulte la Tabla de Materiales/Equipos Específicos).
- Etiquete tubos de 12 x 75 mm.
- Etiquete dos tubos para cada participante: un tubo para el ensayo de fagocitosis (etiquete este tubo con tinta negra y una "F" para el ensayo de actividad de fluorína [FITC]) y un tubo para el ensayo de actividad de explosión oxidativa (OB) (etiquete este tubo con tinta roja y una "H" para dihidroetidio [HE]).
nota: Se recomienda el uso de tubos estériles de 12 x 75 mm para minimizar la activación celular no deseada y el aumento asociado del ruido de fondo.
- Etiquete tres tubos para los controles del ensayo: un tubo para el ensayo de fagocitosis (control FITC: etiquete este tubo con tinta negra y una "F"), un tubo para el ensayo de actividad OB (control HE: etiquete este tubo con tinta roja y una "H") y un tubo para el control negativo (solo sangre: etiquete este tubo con tinta verde y "solo sangre").
- Prepare las soluciones madre al menos un día antes del día del ensayo.
- Prepare la solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Diluir 100 ml de PBS 10x con 900 ml de 18,2 MΩ H2O. Filtro esterilizar con un filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Prepare la glucosa PBS estéril. Disolver 1,0 g de glucosa en 100 ml de PBS. Filtro esterilizar con un filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Prepare el tampón de citrato estéril de 0,1 M. Disuelva 1,2 g de ácido cítrico y 1,1 g de citrato de sodio en 100 ml de 18,2 MΩ H2O. Ajuste el pH a 4,0. Filtro esterilizar con un filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Prepare la solución madre de AE. Resuspender 1,0 mg de HE en 1,0 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Mezclar suavemente, alícuota, y almacenar a -20 °C hasta su uso.
- Prepare la solución madre de Staphylococcus aureus (S. aureus) marcada por la FITC (2 x 109 partículas/ml). Vuelva a suspender 10 mg de S. aureus marcado con FITC en 1,5 ml (o la cantidad adecuada) de PBS. Dividir en tres alícuotas de 500 μl y sonicar según las recomendaciones del fabricante. Alícuota y almacenar a -20 °C hasta su uso.
- Prepare la solución madre de S. aureus sin etiquetar (2 x 109 partículas/ml). Vuelva a suspender 100 mg de S. aureus sin etiquetar en 15 ml (o la cantidad adecuada) de PBS. Dividir en treinta alícuotas de 500 μl y sonicar según las recomendaciones del fabricante. Alícuota y almacenar a -20 °C hasta su uso.
- Prepare nuevas soluciones de trabajo el día del ensayo.
- Prepare la solución de trabajo de HE. Transfiera 10 μl de solución madre de HE descongelada a 990 μl de glucosa PBS. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
- Prepare la solución de trabajo de S. aureus marcada con FITC (133.333 partículas/μl). Transfiera 70 μl de solución madre de S. aureus descongelada marcada con FITC a 980 μl de PBS. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
- Prepare la solución de trabajo de S. aureus sin etiquetar (133.333 partículas/μl). Transfiera 70 μl de solución madre de S. aureus descongelada y sin marcar a 980 μl de PBS. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
- Prepare la solución de enfriamiento. Añadir 750 μl de solución de azul de tripano al 0,4% a 11,25 ml de tampón de citrato 0,1 M estéril. Mantener en un baño de agua helada hasta su uso.
- Pídele a un flebotomista certificado que le extraiga sangre de acuerdo con las pautas de la Organización Mundial de la Salud para la extracción de sangre.
- Extraiga sangre en un tubo de extracción de sangre de 4 ml que contenga ácido dipotásico etilendiaminotetraacético (K2EDTA). Invierta el tubo de extracción de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recolección de sangre a temperatura ambiente en un balancín de sobremesa hasta que lo use. Utilice esta sangre para el hemograma completo (CBC) con el análisis diferencial de glóbulos blancos (WBC) descrito en el paso 1.2.1.
- Extraiga sangre en un tubo de extracción de sangre de 4 ml que contenga heparina de litio. Invierta el tubo de extracción de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recolección de sangre a temperatura ambiente (RT) en un balancín de sobremesa hasta su uso. Utilice esta sangre para el ensayo de fagocitosis de monocitos y granulocitos y actividad OB descrito en el paso 2.
- Determine la cantidad de bacterias (es decir, S. aureus) que se necesitarán para completar el ensayo de cada muestra.
- Utilice un analizador de hematología para realizar un análisis diferencial de hemograma completo con leucocitos en la sangre, tal como se describe en las instrucciones del fabricante. Anote el recuento de leucocitos (en células/ml), los valores de %neutrófilos y %monocitos.
- Utilice las siguientes ecuaciones para determinar los recuentos de neutrófilos y monocitos para cada muestra.
Recuento de neutrófilos (en células/ml) = % de neutrófilos × leucocitos (en células/ml)
Recuento de monocitos (en células/ml) = % de monocitos × leucocitos (en células/ml)
- Utilice las siguientes ecuaciones para determinar el recuento de fagocitos para cada muestra y el número de fagocitos presentes en 100 μl de la muestra.
Recuento de fagocitos (en células/ml) = Recuento de neutrófilos (en células/ml) + Recuento de monocitos (en células/ml)
Número de fagocitos en 100 μl = (recuento de fagocitos (en células/ml))/10
- Utilice la siguiente ecuación para determinar el número de bacterias (es decir, S. aureus) necesarias para cada muestra y la cantidad de solución de trabajo de S. aureus marcada con FITC o S. aureus sin marcar (133,333 partículas/ml) que se debe agregar a cada tubo.
nota: La relación bacteria/fagocito objetivo es de 8:1.
Número de bacterias necesarias = Número de fagocitos en 100 μl × 8
Volumen de FITC o solución de trabajo no marcada necesario (en μl) = (número de bacterias necesarias)/(133.333 partículas/μl)
>2. Realizar ensayo
- Prepare la sangre entera para el ensayo.
- Para cada participante y tubo de control, utilice una punta de pipeta de longitud extendida para transferir 100 μl de sangre entera desde el tubo de extracción de sangre con heparina de litio hasta el fondo de un tubo de 12 x 75 mm debidamente etiquetado. Reemplace caps.
nota: Tenga cuidado de evitar que la sangre entre en contacto con los lados de los tubos de 12 x 75 mm.
- Utilice una micropipeta para añadir 10 μl de solución de trabajo de AE a los tubos marcados con tinta roja y una "H", incluido el tubo de control de AE. Reemplace las tapas y el vórtice brevemente.
- Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 15 min. Luego, transfiera inmediatamente todos los tubos a un baño de agua helada durante 12 min.
nota: Use una rejilla de metal abierta y agite suavemente la rejilla cada 5 minutos para asegurarse de que los tubos se calienten o enfríen rápida y adecuadamente.
- Agregue bacterias (es decir, S. aureus) a la muestra y a los tubos de control.
- Utilice una micropipeta para añadir la cantidad adecuada (calculada en el paso 1.2.4) de solución de trabajo de S. aureus sin etiquetar a los tubos marcados con tinta roja y una "H", incluido el tubo de control HE. Reemplace las tapas y el vórtice brevemente.
- Utilice una micropipeta para añadir la cantidad adecuada (calculada en el paso 1.2.4) de solución de trabajo de S. aureus marcada con FITC a los tubos marcados con tinta negra y una "F", incluido el tubo de control FITC. Reemplace las tapas y el vórtice brevemente.
- Vértice el tubo de control de "solo sangre", pero no le agregue ningún tipo de bacteria (es decir, S. aureus).
- Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 20 min. Utilice una rejilla metálica abierta y agite suavemente la rejilla cada 5 min para asegurarse de que los tubos se calientan rápida y adecuadamente. Después del período de incubación, transfiera inmediatamente todos los tubos a un baño de agua helada durante 1 minuto.
- Lavar las células.
- Utilice una pipeta repetidora para añadir 100 μl de solución fría helada a todos los tubos. Vuelva a colocar las tapas, el vórtice brevemente y luego incube todos los tubos en hielo durante 1 minuto.
- Utilice una pipeta repetidora para añadir 1 ml de PBS helado a todos los tubos. Vierta Vortex brevemente, y luego agregue 2 ml adicionales de PBS helado a todos los tubos y reemplace las tapas. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 4 °C y 270 x g, y luego aspirar el sobrenadante.
- Repita el paso 2.3.2 una vez (un total de 2 lavados).
- Preparar muestras para la citometría de flujo.
- Utilice una pipeta repetidora para añadir 50 μl de suero fetal bovino helado a todos los tubos. Brevemente vórtice todos los tubos.
- Transfiera todos los tubos a un carrusel apropiado y utilice una estación de trabajo automatizada de preparación de lisis celular con reactivos de lisis de glóbulos rojos (RBC) y de fijación de leucocitos para lisar los glóbulos rojos y fijar los leucocitos como se describe en las instrucciones del fabricante.
