Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Configuración experimental
- Utilice hojas de papel de filtro (láminas de poliéster fibroso hidroxilado, consulte la Tabla de Materiales).
- Tiras recortadas de 3 x 15 mm para un niño de 1 mes y en forma de L para niños mayores y adultos (5 x 20 x 10 mm (brazo corto de la L)).
- Inserte un pedazo de papel de filtro en cada fosa nasal de un bebé con pinzas. Coloque el papel de filtro en la parte anterior del cornete inferior (aproximadamente 1 cm dentro de la fosa nasal para los neonatos y 1,5 cm para todas las demás edades).
- Coloque a los recién nacidos en una cama y dele agua azucarada para que se sientan cómodos.
nota: Para los niños de todas las demás edades, el muestreo se realiza más fácilmente con el sujeto sentado en una silla.
- Para los niños mayores, inserte el brazo largo del papel de filtro en forma de L en cada fosa nasal.
- Aplique una pinza nasal alrededor de las fosas nasales para minimizar las molestias y evitar la pérdida accidental del papel de filtro.
- Retire los papeles de filtro después de 2 minutos de absorción.
- Coloque los papeles de filtro en tubos etiquetados y congélelos inmediatamente a -80 °C.
- Tome nota de cualquier síntoma de infección de las vías respiratorias que muestre el niño el día de la toma de muestras.
- Registre cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurra durante los 2 minutos de muestreo.
>2. Cuantificación de inmunomediadores de la vía aérea
- Tome hasta 10 muestras aleatorias del congelador. Registre los números de identificación. Mantenga las muestras en hielo durante todo el proceso de trabajo.
- Después de descongelar en hielo, sumerja los papeles de filtro (por sujeto) de ambas fosas nasales en 300 μL de tampón recién preparado (consulte la Tabla de Materiales) que contenga una tableta completa de inhibidor de la proteasa (consulte la Tabla de Materiales) por 25 mL de tampón.
- Ajuste el volumen del tampón según el tamaño del papel de filtro.
- Utilice 300 μL de tampón para papeles de filtro de 3 x 15 mm de tamaño.
- Si solo se dispone de un papel de filtro, utilice la mitad del volumen del tampón (150 μL).
- Transfiera las muestras a un agitador de placas (400 rpm) durante 5 min. Use un temporizador.
- Transfiera los papeles de filtro húmedos y el tampón de ensayo a la copa de un filtro de tubo de acetato de celulosa (tamaño de poro de 0,22 μm) colocado dentro de un tubo de microcentrífuga (consulte la tabla de materiales).
- Centrifugar a 16.000 x g durante 5 min en una centrífuga enfriada (a 4 °C) para obtener extracto nasal filtrado en el tubo.
- Retire la copa y mantenga los tubos en hielo mientras alícuota el extracto nasal en los pocillos de las placas de almacenamiento de baja unión a proteínas (consulte la Tabla de materiales).
- Almacenar a -80 °C hasta el análisis.
- Determine las concentraciones de citocinas y quimiocinas en los extractos nasales utilizando un sistema de matriz multiplexada de alta sensibilidad basado en electroquimioluminiscencia (consulte la Tabla de materiales).
c: Aquí se realizó un ensayo humano de citocinas TH1/TH2 de 10 plex, un ensayo de quimiocinas de 9 plex e interleucina-17A (IL-17A), factor de crecimiento transformante beta1 (TGF-β1) y linfopoyetina del estroma tímico (TSLP).
- Para los ensayos, incubar los extractos nasales durante la noche a 4 °C. Realice las mediciones según el protocolo estándar del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
nota: Los inmunoensayos (consulte la Tabla de materiales) suelen tener un alto rango dinámico para la medición que oscila entre 1 y 10.000 pg/mL, pero para algunos ensayos, puede ser de 100.000 pg/mL. Esto significa que todas las muestras se pueden analizar a la misma dilución, limitando así la influencia de diluciones diferentes en sujetos sanos y enfermos, como es el caso de otros inmunoensayos similares. El límite inferior de detección para todas las citocinas fue de 1 pg/mL o menos, y para las quimiocinas, osciló entre 1 y 50 pg/mL. El TSLP no fue detectable en el 98% de las muestras a 1 mes de edad.
