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1. Diseño y preparación de los péptidos
- Adquiera la secuencia de la proteína de fusión de interés de una base de datos pública como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o la base de datos de patógenos virales (https://www.viprbrc.org). Elija el sitio de reconocimiento de la proteasa que precede al péptido de fusión e incluya 2-3 aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia.
- Al pedir los péptidos, modifíquelos con el par FRET 7-metoxicumarina-4-il acetilo (MCA) en el N-terminal y N-2,4-dinitrofenilo (DNP) en el extremo C-terminal.
nota: Varios proveedores proporcionan estas modificaciones. El precio y el plazo de entrega dependen del proveedor elegido. Sin embargo, existen modificaciones alternativas que varían en sensibilidad y requieren ajustes del lector de placas en términos de longitudes de onda.
- Vuelva a suspender el péptido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante pipeteándolo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Por ejemplo, resuspender péptidos en etanol al 70% hasta la concentración final de 1 mM.
- Opcionalmente, añadir el tubo que contiene el péptido y el disolvente en un baño de sonicación hasta que se resuspenda por completo si el péptido no se resuspende muy bien mediante pipeteo.
- Alicuente el péptido en tubos resistentes o que humedezcan la luz para proteger el péptido del blanqueo. Mantenga los tamaños de alícuotas pequeños para evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación (por ejemplo, 100 μL). Almacene las alícuotas a -20° C.
>2. Preparando el lector de placas de fluorescencia
- Encienda el lector de placas y espere hasta que finalice la autoevaluación.
- Abra el software operativo de la computadora conectada y asegúrese de que esté conectado al lector de placas.
- Abra el ajuste de temperatura y ajústelo a 30 °C (o la temperatura requerida para un rendimiento óptimo de la proteasa).
- Haga clic en Control | Configuración del instrumento para configurar el experimento.
- Elija Kinetic.
- Seleccione Fluorescencia.
- Introduzca las longitudes de onda de excitación y emisión: 330 nm y 390 nm respectivamente.
- Anule la selección de Corte automático.
- Seleccione Medio, sensibilidad normal.
- Elija un tiempo de ejecución de 1 h para el ensayo y seleccione una medición cada 60 s.
- Ajuste 5 s de mezcla antes de la primera medición y 3 segundos antes de cada medición
- Seleccione los pocillos que desea leer e inicie el ensayo.
>3. Preparando el ensayo
- Prepare el tampón de ensayo calculando las cantidades adecuadas para cada ingrediente y añadiéndolo. Para la furina, haga un tampón que consista en 100 mM de HEPES, 1 mM de CaCl2, 1 mM de 2-mercaptoetanol y 5% de Triton X-100. Para la tripsina, use una solución salina estándar tamponada con fosfato (PBS).
nota: Volúmenes de 10 mL o menos son suficientes. Dependiendo de la(s) proteasa(s) utilizada(s) en el ensayo, el tampón varía.
- Enfríe el tampón con hielo.
- Coloque la placa de ensayo sobre hielo con una placa metálica delgada debajo para favorecer el enfriamiento y la estabilidad. Utilice una placa de poliestireno negro sólido de 96 pocillos con un fondo plano y sin tratar.
nota: Es esencial utilizar placas negras para evitar "fugas" fluorescentes de los pozos adyacentes.
- Calcule la cantidad adecuada de proteasa a añadir para cada reacción basándose en publicaciones previas o datos experimentales. En el caso de la furina, utilizar 1 unidad por reacción, lo que corresponde a 0,5 μL. Para la tripsina, use 0,5 μL de tripsina TPCK de 160 nM.
- Por muestra: preparar 3 réplicas técnicas por ensayo en un volumen total de 100 μL por muestra.
nota: Se evaluó experimentalmente que no hay diferencia si el pipeteo se realiza en condiciones de luz normales o con luz atenuada. Sin embargo, los péptidos no deben exponerse a la luz durante un período prolongado de tiempo.
- Pipetear la cantidad adecuada de tampón de ensayo (94,5 μL como se describe en el paso 3.1) en cada pocillo.
- Agregue la proteasa a cada pocillo. Tanto para la furina como para la tripsina TPCK, utilizar 0,5 μL por muestra. A 6 pocillos (3 pocillos para un control en blanco y 3 pocillos para un control de péptidos), agregue 0,5 μL de tampón en lugar de la proteasa respectiva.
- Agregue el péptido hasta una concentración final de 50 μM en cada pocillo, excepto en el control en blanco. En este caso, se preparó el péptido de pipeta 5 μL como se describe en el paso 1.3. Añada 5 μL de tampón al control en blanco en lugar de péptido.
nota: Inicialmente se probaron varias concentraciones del péptido con las concentraciones de enzimas descritas para asegurarse de que las enzimas estaban saturadas.
- Inserte la placa en el lector de placas de fluorescencia y haga clic en iniciar.