Un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos para detectar la actividad proteolítica de las proteasas

Abstract

Fuente: Jaimes, J. A., et al. A Ensayo de Escisión de Péptidos Fluorogénicos para Detectar la Actividad Proteolítica: Aplicaciones para la activación de la proteína de pico del coronavirus. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un ensayo para detectar la actividad proteolítica de las proteasas utilizando péptidos fluorogénicos. La proteasa reconoce su sitio de escisión en el péptido, escindiéndolo y separando el extinguidor del fluoróforo, lo que permite su emisión de fluorescencia. La señal de fluorescencia se detecta y analiza para comprobar la eficiencia de escisión de diferentes variantes de péptidos.

Protocol

1. Diseño y preparación de los péptidos

1. Adquiera la secuencia de la proteína de fusión de interés de una base de datos pública como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o la base de datos de patógenos virales (https://www.viprbrc.org). Elija el sitio de reconocimiento de la proteasa que precede al péptido de fusión e incluya 2-3 aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia.
2. Al pedir los péptidos, modifíquelos con el par FRET 7-metoxicumarina-4-il acetilo (MCA) en el N-terminal y N-2,4-dinitrofenilo (DNP) en el extremo C-terminal.
   nota: Varios proveedores proporcionan estas modificaciones. El pr....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
péptidos	Biomatik	N/A
Furina	Neb	P8077S
Tripsina, tratada con TPCK	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tritón-X100	Sigma-Aldrich	X100
Pbs	Corning	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Dispositivos moleculares	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Dispositivos moleculares	N/A
Placa de 96 pocillos (poliestireno negro macizo con fondo plano y sin tratar)	Coprotagonista	3915
Tubos de amortiguación ligeros	Laboratorio Watson	131-915BL o 131-915BR