Monitorización de la llegada de proteínas de superficie marcadas con GFP a la red Trans-Golgi utilizando nanocuerpos funcionalizados

Resumen

Fuente: Buser, D. P., et al. Análisis de la absorción endocítica y el transporte retrógrado a la red Trans-Golgi utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para estudiar la absorción y el transporte retrógrado de nanocuerpos funcionalizados para comprender sus vías de tráfico intracelular. Mediante la introducción de sulfato radiomarcado y la utilización de técnicas de aislamiento y detección, este método permite el estudio de la absorción endocítica y la llegada de proteínas de carga a través de la red trans-Golgi.

Protocolo

1. Absorción de nanocuerpos funcionalizados por células cultivadas (para análisis de sulfatación)

1. En una campana de cultivo celular, siembre ~ 400,000 a 500,000 células HeLa que expresan de manera estable una proteína reportera marcada con GFP en placas de 35 mm o en grupos de 6 pocillos con medio completo que contiene antibióticos (medio Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS), 100 unidades/mL de estreptomicina, 2 mM de l-glutamina y 1,5 μg/mL de puromicina).
   nota: Como se mencionó anteriormente, aquí usamos células HeLa que expresan EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP con fines ilustrativos. Además de las líneas celulares estables, también se puede utilizar HeLa transfectado transitoriamente.
2. Incubar las células O/N a 37 °C en una incubadora de 7,5% de CO₂ para que proliferen.
   nota: Las células deben tener una confluencia de ~80% al día siguiente.
3. Retire el medio completo, lave 2 veces con 1x PBS en RT y prive a las células con medio libre de sulfatos (SFM) durante 1 h a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 7,5%
   nota: El SFM se prepara añadiendo 10 mL de solución de aminoácidos MEM (50x), 5 mL de L-glutamina (200 mM), 5 mL de solución vitamínica (100x) y 900 μL de CaCl₂·2H₂O a 500 mL de sales equilibradas de Eagle. Pasar a través de un filtro de 0,22 μm y una alícuota.
4. En una campana o banco ventilado designado para trabajos con radiactividad, prepare un medio de marcado de sulfato que contenga 0,5 mCi/mL [³⁵S] de sulfato como sal de sodio en SFM.
   cautela: Manipule cuidadosamente todas las soluciones que contengan radiactividad. Solo trabaje en campanas o bancos designados. Todo el material (puntas, tubos, placas, etc.) o tampones de lavado en contacto con la radiactividad deben recogerse y eliminarse por separado. Haga esto también para todos los pasos a continuación (pasos 1.5-1.18).
5. Agregue VHH-2xTS en 1x PBS en el medio de marcado de sulfato hasta una concentración final de 2 μg/mL.
   nota: Como control, incluya también VHH-std u otro sitio de nanocuerpo desprovisto de sitios TS para demostrar un etiquetado específico.
6. Sustituya el SFM por 0,7 mL de medio de marcaje de sulfato que contenga 0,5 mCi/mL de sulfato [35S] y 2 μg/mL de VHH-2xTS e incube las células durante 1 h a 37 °C en una incubadora de 7,5% de CO₂ diseñada para trabajar con radiactividad.
   nota: Dependiendo del experimento planificado, es necesario ajustar el tiempo de sulfatación de los nanocuerpos. Además, para determinar la cinética de llegada de TGN, se realiza el etiquetado para diferentes momentos (por ejemplo, para 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
7. Retire el medio de etiquetado y lave las celdas 2-3 veces con 1x PBS helado en una placa de enfriamiento o hielo.
8. Añadir 1 mL de tampón de lisis (PBS que contiene un 1% de Triton X-100 y un 0,5% de desoxicolato) suplementado con 2 mM de PMSF y 1x cóctel de inhibidores de la proteasa e incubar las células durante 10-15 min en una plataforma oscilante a 4 °C.
9. Raspe y transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mL, haga un vórtice del lisado y colóquelo durante 10-15 minutos en un rotador de extremo a extremo a 4 °C.
10. Preparar un lisado postnuclear por centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
11. Con un tubo nuevo de 1,5 mL, prepare 20-30 μL de una suspensión de perlas de níquel en un tubo de 1,5 mL y lávese una vez con 1x PBS granulándolas suavemente a 1.000 x g durante 1 min.
    nota: En lugar de perlas de níquel, se pueden utilizar perlas de estreptavidina (si el nanocuerpo está biotinilado) o perlas de proteína A con una IgG contra un epítopo del nanocuerpo (T7- o HA-tag).
12. Transfiera el lisado postnuclear a un tubo de 1,5 ml que contenga perlas de níquel e incube durante 1 h a 4 °C en un rotador de extremo a extremo para aislar los nanocuerpos. Extraer una alícuota (50-100 μL) del lisado postnuclear y hervir en tampón de muestra SDS para el posterior análisis de inmunotransferencia del nanocuerpo total asociado a la célula, el reportero de GFP y el control de carga.
13. Lave las perlas 3 veces con 1x PBS o tampón de lisis granulando suavemente a 1.000 x g durante 1 min.
    nota: Para un lavado más estricto de las perlas, se pueden incluir 20 mM de imidazol en PBS o tampón de lisis.
14. Retire con cuidado todo el tampón de lavado de las perlas, agregue 50 μL de tampón de muestra 2x y hierva durante 5 min a 95 °C.
15. Cargue ambas perlas hervidas en un gel midi 12.5% SDS-PAGE y ejecute de acuerdo con el protocolo PAGE estándar hasta que el tinte de referencia (por ejemplo, azul de bromofenol) haya llegado al final del gel separador.
    nota: El análisis de inmunotransferencia del nanocuerpo total asociado a la célula, el indicador de GFP y el control de carga también se pueden realizar utilizando un mini SDS-PAGE al 12,5% o un gel de gradiente prefabricado.
16. Fije el gel separador en ~ 30 mL de tampón de fijación (10% de ácido acético y 45% de metanol en ddH₂O) durante 1 h en RT, lave el gel tres veces con ~ 50 mL de agua desionizada y prepárese para el secado en gel.
17. Secado de geles SDS-PAGE.​
    1. Coloque con cuidado el gel fijo sobre una película adhesiva estirada y cúbrala con papel de filtro precortado.
    2. Coloque el gel con el papel de filtro en la parte superior de la plataforma de secado, coloque la cubierta de vacío y encienda la bomba de vacío para el secado en gel. Secar el gel durante 3-5 h.
    3. Retire la película adhesiva y coloque el gel seco en un casete de autorradiografía equipado con una pantalla de fósforo.
18. Imagen autorradiografía utilizando un generador de imágenes de pantalla de fósforo. Siga las instrucciones del fabricante.
    nota: Dependiendo de la intensidad de la señal, los geles secos deben exponerse durante más tiempo con pantallas de fósforo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-GFP	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	El producto es distribuido por SigmaAldrich, pero fabricado por Roche
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich
Suero fetal de ternera (FCS)	Biooeste
Azufre-35 como sulfato de sodio	Análisis de Hartmann	ARS0105	El producto contiene 5 mCi
Placas de 6 pocillos	TPP	92406
Paraformaldehído (PFA)	Applichem	A3813
Fluoromount-G	Biotecnología del Sur	0100-01
Geles Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 pocillos	Bio-Rad	456-1096