Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Cultura de parásitos
NOTA: Siga las regulaciones locales para el manejo de patógenos humanos.
- Mantener los parásitos de Plasmodium falciparum de acuerdo con el protocolo estándar descrito anteriormente en el medio de cultivo de parásitos (ver Tabla de Materiales).
- Mantenga los parásitos estrechamente sincronizados con el tratamiento con sorbitol como se describió anteriormente.
- Para asegurar la expresión VAR2CSA en la superficie de los eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum (EI), se realizan rondas repetidas de selección inmunomagnética utilizando un anticuerpo anti-VAR2CSA (por ejemplo, el anticuerpo PAM1.4, una IgG monoclonal humana de VAR2CSA específica de reacción cruzada) acoplada a perlas magnéticas de proteína G.
- En resumen, incube trofozoítos-IE en etapa tardía con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo anti-VAR2CSA y seleccione positivamente usando un imán.
- Expandir los parásitos seleccionados en cultivo durante unos ciclos hasta que la parasitemia sea de al menos 5%.
- Alternativamente, seleccione parásitos que se unan a CSA inmovilizado por plástico (el receptor de VAR2CSA) como se describió anteriormente.
- Para verificar VAR2CSA expresión en los parásitos seleccionados, realice la citometría de flujo como se describió anteriormente.
- En resumen, etiquete los trofozoítos-IE en etapa tardía con el mismo anticuerpo utilizado para la selección magnética (paso 1.3) seguido de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia.
- Mida la reactividad de la superficie IE mediante citometría de flujo. La selección exitosa de anticuerpos normalmente da como resultado una población de parásitos que expresa VAR2CSA en la mayoría de los parásitos (≈80%).
- Para el ensayo de fagocitosis, utilice trofozoíto-IE purificados en etapa media a tardía. Realice la purificación mediante separación magnética como se describió anteriormente.
nota: Para determinar con precisión el estadio de los parásitos, se debe realizar una tinción de Giemsa en frotis de sangre seguida de una observación con microscopía óptica. Siga los procedimientos estándar y las pautas morfológicas descritas anteriormente. La purificación en etapa tardía también se puede realizar utilizando un medio de gradiente de densidad. Sin embargo, el rendimiento de IE, en nuestra experiencia, es menor y, por lo tanto, es preferible la purificación magnética.
- Para la separación magnética, centrifugar el cultivo de parásitos (5-10% de parasitemia) a 500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de medio de cultivo de parásitos.
- Agregue la suspensión del parásito en una columna de CS de Claricep Flash Silica acoplada a un imán (consulte la Tabla de materiales) y deje que pase lentamente a través de la columna. Los trofozoítos-IE son paramagnéticos (debido a la presencia de hemozoína) y permanecerán en la malla de la columna.
- Lave la columna con 50 mL de medio de cultivo de parásitos y eluya los IE de la columna magnética usando 50 mL de medio de cultivo de parásitos.
- Centrifugar el eluido desde 1.5.3 a 500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 1 mL de medio de cultivo de parásitos.
- Con un hemocitómetro, cuente el número de IE (fácilmente identificables por microscopía óptica como eritrocitos con pigmento oscuro de hemozoína) y el número total de células para calcular la parasitemia final (porcentaje de IE).
nota: Utilice únicamente parásitos con al menos un 80% de pureza (80% de IE).
- Con base en el número de muestras de suero/anticuerpos planificadas para las pruebas, estime la cantidad total de IE necesarias y amplíe los cultivos de parásitos en consecuencia. Un matraz de cultivo de 75cm2 con 25 mL de cultivo con 5% de hematocrito y 5-10% de parasitemia debería producir suficientes IE para hacer funcionar una placa completa de 96 pocillos. Para una placa completa (42 muestras más 6 controles duplicados), se necesita un mínimo de 1,5 mL de suspensión de parásitos a 3,3 x 107 IEs/mL.
2. Células THP-1
NOTA: La línea celular THP-1 se utiliza en este ensayo. Esta línea celular de monocitos se deriva de un paciente con leucemia monocítica y se puede comprar en la American Type Culture Collection (ATCC). Mantenga la línea celular de acuerdo con las instrucciones del proveedor en el medio de cultivo THP-1 (consulte la tabla de materiales).
- Para un mantenimiento regular, inicie el cultivo celular THP-1 a 2-4 x 105 células/mL y el subcultivo cuando la concentración celular alcance 8 x 105 células/mL.
nota: No permita que la concentración de células supere 1 x 106 células/mL y lleve un registro del número de paso. Evite el uso de celdas que estén más allá del pasaje 25. El tiempo medio de duplicación de la línea celular THP-1 varía entre 19-50 h. Determine el tiempo de duplicación del lote de células antes de comenzar los experimentos de fagocitosis. Esto ayudará a estimar aproximadamente la cantidad necesaria de cultivo necesaria para analizar un número determinado de muestras de suero (por ejemplo, para una placa completa de 96 pocillos, se necesitan 10 mL de cultivo a 5 x 105 células/mL).
- Revise periódicamente las células THP-1 para la expresión superficial de los receptores Fcγ I (CD64), II (CD32) y III (CD16) como se describió anteriormente.
- En resumen, tiñir las células THP-1 (por separado) con anticuerpos anti-CD64, anti-CD32 y anti-CD16 marcados con fluorescencia (Tabla de materiales) durante 30 min a temperatura ambiente (dilución 1:100 preparada en suero fetal bovino (FBS) al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Lavar tres veces con 2% de FBS en PBS y medir las manchas superficiales mediante citometría de flujo.
nota: Las células THP-1 son negativas para CD16 y positivas para CD32 y CD64 como se informó anteriormente (Figura 1).
- Para el ensayo de fagocitosis, prepare un matraz de cultivo celular THP-1 con 2,5 x 105 células/mL el día anterior al experimento para producir alrededor de 5 x 105 células/mL el día del ensayo.
nota: Asegúrese de que haya 4-6 x 105 células/mL el día del ensayo.
>3. Ensayo de fagocitosis (Figura 2)
- Antes de iniciar el ensayo, bloquee (>1 h) dos placas de 96 pocillos de fondo redondo (una para la opsonización y otra para la fagocitosis) utilizando 150 μL por pocillo de FBS estéril al 2% en PBS.
nota: Etiquete la placa 1 como placa de opsonización y utilícela tanto para la tinción como para la opsonización con bromuro de etidio (EtBr). Etiquete la placa 2 como placa de fagocitosis y utilícela tanto para la siembra de células THP-1 como para la etapa de fagocitosis.
- Tinción y opsonización de parásitos
- Tome la suspensión de IE preparada en 1.6 y ajuste el recuento de células a 3.3 x 107 IEs/mL agregando medio de cultivo de parásitos y bromuro de etidio (EtBr) para lograr una concentración final de 2.5 μg/mL (dilución 1:40, a partir de un stock de 0.1 mg/mL).
nota: EtBr tiñe el ADN del parásito, lo que permite la detección por citometría de flujo.
cautela: El EtBr es un mutágeno e irritante de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Use la protección adecuada y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales.
- Retire la solución de bloqueo de una de las placas de 96 pocillos (placa de opsonización), agite la placa y elimine el exceso de líquido sobre un trozo de papel toalla.
- Agregue 30 μL por pocillo de la suspensión IE preparada anteriormente en la mitad superior de la placa. Deje un pocillo vacío y agregue 30 μL de medio de cultivo de parásitos (sin IE para el control THP-1 solo). (Figura 3A). Incubar durante 10 min a temperatura ambiente y protegido de la luz.
- Añadir 170 μL por pocillo de medio de cultivo de parásitos. Gire la placa a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente y retire el sobrenadante pasando la placa sobre un contenedor de residuos adecuado.
- Lave los IE marcados con EtBr dos veces más con 200 μL por pocillo de medio de cultivo de parásitos, girando la placa a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente. El sobrenadante del primer lavado se puede eliminar moviendo la placa. Retire con cuidado el sobrenadante del segundo lavado con una pipeta multicanal para asegurarse de que se elimina todo el volumen del medio de lavado. No moleste el pellet.
- Vuelva a suspender los IE marcados con EtBr en 30 μL de solución de anticuerpos/plasma/suero preparada a las concentraciones deseadas en un medio de cultivo de parásitos.
- Incluya siempre los siguientes controles (Figura 3B): un control sin control de células IEs/THP-1 (medio de cultivo de parásitos); un control sin ningún anticuerpo o plasma/suero (control no opsonizado); un control positivo utilizando el anticuerpo anti-eritrocitos humanos de conejo disponible comercialmente en una dilución de 1:100 (ver Tabla de Materiales); dos controles plasmáticos/séricos negativos con una dilución 1:5 (un grupo de pacientes que no han recibido paludismo y otro de hombres expuestos al paludismo); y un control sérico positivo con dilución 1:5 (un grupo de mujeres expuestas a la malaria, que han estado embarazadas previamente (preferiblemente multigrávidas))
nota: Una dilución 1:100 para el control positivo parece funcionar de manera consistente en diferentes lotes de anticuerpos comprados (no se muestran los datos). Sin embargo, se recomienda descartar variaciones entre lotes probando varias diluciones cada vez que se utilice un nuevo lote de anticuerpos.
- Incubar durante 45 min en la oscuridad a 37 °C.
- Preparación y fagocitosis de las células THP-1
- Mientras se opsonizan los IE (3.2.8), comience a preparar las células THP-1.
- Retire las células THP-1 del matraz de cultivo, gírelas hacia abajo (500 x g durante 5 min a temperatura ambiente), decante el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo celular THP-1.
- Volver a centrifugar (500 x g durante 5 min a temperatura ambiente), decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de celda en 1 mL de medio de cultivo celular THP-1.
- Determine el recuento de células en la solución preparada anteriormente y agregue más medio para obtener una concentración final de 5 x 105 células/mL.
- Retire la solución de bloqueo de la placa de 96 pocillos restante (placa de fagocitosis) moviendo la placa y eliminando el exceso de líquido sobre un trozo de papel toalla.
- Añadir 100 μL por pocillo de la suspensión celular THP-1 preparada en el punto 3.3.4 y volver a introducirla en la incubadora de cultivos celulares (Figura 3C).
- Una vez finalizado el tiempo de incubación de anticuerpos/plasma/suero, añadir 170 μL por pocillo de medio de cultivo del parásito. Gire la placa a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente y retire el sobrenadante pasando la placa sobre un contenedor de residuos adecuado.
- Lave los IE opsonizados dos veces más con 200 μL por pocillo de medio de cultivo de parásitos, girando la placa a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente. El sobrenadante del primer lavado se puede eliminar moviendo la placa. Retire con cuidado el sobrenadante del segundo lavado, utilizando una pipeta multicanal para asegurarse de que se ha eliminado todo el volumen de medio de lavado. No moleste el pellet.
- Por último, vuelva a suspender los IE opsonizados en 100 μL de medio de cultivo celular THP-1 precalentado. Transfiera 50 μL de suspensión de IE opsonizada a cada pocillo de la placa de fagocitosis. Dado que hay un total de 100 μL de IE, cada dilución de anticuerpo/suero puede ejecutarse por duplicado en la placa de fagocitosis (Figura 3D)
nota: La cantidad de células IE y THP-1 utilizadas en el ensayo corresponde a una relación de 10:1.
- Incubar durante 40 min en la oscuridad a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2).
nota: No permita que la fagocitosis continúe durante más de 40 minutos.
- Detenga la fagocitosis por centrifugación a 4 °C (500 x g, 5 min) y deseche el sobrenadante agitando la placa. Añadir 150 μL de solución de lisada de cloruro de amonio a temperatura ambiente (Tabla de Materiales) y mezclar por pipeteo, incubar durante exactamente 3 min.
nota: Este paso lisará los eritrocitos que no han sido fagocitados por las células THP-1.
- Detenga la lisis añadiendo 100 μL de FBS helado al 2% en PBS. Girar la placa a 4 °C (500 x g durante 3 min) y retirar el sobrenadante pasando la placa por encima de un contenedor de residuos adecuado.
- Lavar tres veces con 200 μL por pocillo de FBS al 2% helado en PBS girando la placa a 4 °C (500 x g durante 3 min). Después del lavado final, vuelva a suspender en 200 μL de FBS al 2% helado en PBS e inmediatamente, analice por citometría de flujo.
nota: Publicaciones anteriores han utilizado la fijación celular en paraformaldehído al 2% antes de la citometría de flujo31, pero los resultados presentados aquí se obtuvieron inmediatamente después de la finalización del ensayo. No se recomienda posponer la adquisición de datos de citometría de flujo almacenando la placa a 4 °C, ya que el porcentaje de células EtBr+ THP-1 decae rápidamente (Figura 4).
>4. Adquisición y análisis de citometría de flujo
NOTA: Se puede utilizar cualquier citómetro de flujo que admita el formato de placa de 96 pocillos y que tenga los láseres/filtros adecuados para medir la fluorescencia de EtBr.
- Para la adquisición, compuerta en celdas THP-1 utilizando un gráfico lineal de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral lineal (SSC) utilizando los pozos donde no se agregaron IE (Figura 2A) y adquiera 10,000 eventos en esta puerta.
- Mida la intensidad de fluorescencia para EtBr (FL3-Log) en la puerta THP-1 utilizando un gráfico de histograma.
- Para la compuerta, primera puerta en las celdas THP-1 en un gráfico de densidad FSC vs. SSC, utilizando los pozos donde no se agregaron IE (Figura 5A). A continuación, configure una puerta positiva en un histograma FL3 (EtBr), utilizando las celdas THP-1 (no se agregaron IE) y el control no opsonizado (Figura 5B).
- Copie estas puertas en todas las demás muestras analizadas en la misma placa y determine el porcentaje de células THP-1 positivas para EtBr (células THP-1 que han fagocitado al menos una IE). Para cada una de las muestras analizadas, la fagocitosis se puede informar como los valores absolutos (porcentaje de células EtBr+ THP-1) o como fagocitosis relativa calculada como el porcentaje utilizando el control positivo como máximo.
