NOTA: Los siguientes protocolos describen la preparación de la muestra y la cuantificación de la actividad de las serina proteasas de neutrófilos (NSPs). Los procedimientos experimentales presentados en este trabajo se centran en la medición de la actividad del esputo humano y la elastasa de neutrófilos (NE) o catepsina G (CG). Sin embargo, ligeras adaptaciones en el protocolo de preparación de muestras hacen posible el análisis de células derivadas de la sangre y homogeneizados tumorales. Además, las actividades de la metaloproteinasa de la matriz y la catepsina S pueden investigarse de forma similar mediante sondas FRET específicas
1. Preparación de la muestra: aislamiento celular y separación del sobrenadante
NOTA: Si es posible, el tratamiento del esputo debe realizarse dentro de los 120 minutos posteriores a la expectoración y el esputo debe almacenarse en hielo hasta su posterior procesamiento.
- Si la expectoración espontánea del esputo no es posible, inducir el esputo como se ha descrito anteriormente. Inhale brevemente 200 μg del salbutamol, antagonista del receptor β-2, antes de iniciar el procedimiento de inducción del esputo. Después, inhale una solución salina hipertónica (6%) durante 15 minutos con un nebulizador. Recoja el esputo expectorado en una placa de Petri.
- Separe los grumos de moco de la saliva en una placa de Petri con la ayuda de una punta de pipeta.
- Pesar la mucosidad.
nota: El peso medio de una muestra de moco es de 0,8 g (variando entre 0,1 g y 5 g); 0,1 g suele ser suficiente para realizar los procedimientos mencionados.
- Agregue 4 partes (v/p) de esputolisina al 10% (en PBS) al esputo (por ejemplo, 4 mL de esputolisina al 10% por cada gramo de esputo)
cautela: La esputolisina está compuesta por ditiotreitol concentrado en tampón de fosfato, por lo tanto, manéjelo con cuidado.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) en un agitador oscilante durante 15 minutos para disolver la mucosidad. Por razones de seguridad, coloque el agitador en una campana extractora.
- Apague la reacción añadiendo el mismo volumen de PBS frío (por ejemplo: 1 mL de PBS frío por cada mL de esputolisina al 10%).
- Mezclar por pipeteo para obtener una solución homogénea.
- Filtre la mezcla a través de un colador de células de nailon de 100 μm en un tubo de 50 ml.
- Repita el paso de filtración a través de un colador de células de nailon de 40 μm.
- Centrifugar la solución durante 10 min a 300 x g a 4 °C.
- Transfiera la fracción sobrenadante con cuidado a un tubo nuevo y guárdelo en hielo.
nota: Las fracciones sobrenadantes pueden almacenarse a -20 °C o -80 °C hasta su posterior análisis.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en 500 μL de PBS frío y colóquelo en hielo.
nota: La fracción celular debe procesarse inmediatamente.
>2. Medición de la actividad de la serina proteasa de neutrófilos
NOTA: Aquí, se introducen diferentes métodos para cuantificar la actividad de NSP por medio de reporteros FRET. La elección de la tecnología está dictada por la pregunta biomédica específica y el propósito del experimento. Las sondas presentadas se probaron exhaustivamente para determinar su especificidad frente a un conjunto de enzimas relevantes para los pulmones. Aunque las sondas son específicas para su enzima diana, compruebe siempre la especificidad de la sonda en la muestra clínica de interés. Esto se puede lograr incubando la muestra con un inhibidor de proteasa específico antes de la adición de la sonda, lo que debería eliminar cualquier aumento en la relación donante/aceptor (D/A).
- Cuantificación de la actividad de NSP soluble mediante fluorímetro o ensayo con lector de placas
nota: La actividad de la proteasa en las fracciones solubles de la muestra puede detectarse con cualquier instrumento capaz de detectar fluorescencia.
- Descongela las enzimas en hielo.
- Hasta su uso, mantenga NE y CG en un tampón de almacenamiento ácido (50 mM de acetato de sodio, 200 mM de NaCl, pH 5,5) para evitar la autoescisión.
- Para establecer una curva estándar de enzima, prepare una dilución en serie 1:2 de la enzima (33,9 - 0,271 nM para NE; 42,6 - 0,333 nM para CG) en tampón de activación (10 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl a pH 7,5). El tampón de activación tiene un pH neutro y, por lo tanto, permite que la catálisis enzimática ocurra de manera eficiente.
- Para preparar la concentración estándar más alta (concentración de NE: 33,9 nM), diluya 1 μL de NE (33,9 μM) en 999 μL de tampón de activación.
- Para preparar el segundo patrón (concentración de NE: 16,95 nM), mezcle 200 μL de la primera dilución con 200 μL de tampón de activación.
- Proceda en consecuencia a preparar las diluciones 1:2 restantes.
- El último estándar, que es el blanco, está compuesto por un búfer de activación puro. Se recomienda la medición de duplicados técnicos o triplicados. Durante la preparación del estándar y de la muestra, trate de mantener los viales en hielo.
- Paralelamente a la preparación estándar, diluya las muestras de esputo en un tampón de activación. Diluir las muestras humanas antes de evaluar su actividad proteasa para que permanezcan en el rango lineal de aumento de la señal reportera (relación D/A). Si las muestras de los pacientes se dejaran sin diluir, la escisión se produciría demasiado rápido para un ajuste fiable. Dado que el esputo de un donante sano contiene menos proteasas activas en comparación con las muestras de pacientes con fibrosis quística (FQ) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), generalmente se realizan diferentes diluciones (1:10 para el sobrenadante de esputo sano, 1:20-500 para el sobrenadante de esputo de pacientes con EPOC o FQ)
nota: Con el fin de medir cuantitativamente la actividad de la proteasa en muestras en las que se desconoce su concentración, es necesario medir en paralelo una curva estándar con concentraciones de enzimas conocidas, idealmente en la misma placa. La concentración de enzima activa en el esputo humano se calcula interpolando las pendientes medidas en las muestras de esputo humano con las medidas con las curvas estándar.
- Antes de preparar las muestras para la medición, configure el instrumento. Ajuste la longitud de onda de excitación para la sonda basada en transferencia de energía por resonancia (FRET) NE Förster (NEmo-1) a 354 nm y ajuste la longitud de onda de detección a 400 nm para el donante y 490 nm para el aceptor. Establezca la longitud de onda de excitación para la sonda CG FRET (sSAM) en 405 nm y configure la emisión en 485 (donante) y 580 nm (aceptor).
- Agregue 40 μL de muestras, estándar o en blanco, en los pocillos de una placa negra de media área de 96 pocillos.
- Para preparar la mezcla maestra que contiene los reporteros (concentración del reportero en la mezcla maestra: 10 μM), diluya el material de la sonda (1 mM en dimetilsulfóxido, DMSO) 1:100 en tampón de activación. Prepare el volumen de mezcla maestra necesario multiplicando 10 μL por el número de pocillos de placa requeridos. Para alcanzar la concentración final óptima (2 μM) para la medición de fluorescencia de los reporteros NEmo-1 y sSAM, agregue 10 μL de la mezcla maestra a cada pocillo (que contenga 40 μL de muestra, estándar o en blanco) e inicie la lectura. Por lo tanto, los reporteros NEmo-1 y sSAM monitorearán la actividad de la elastasa soluble de neutrófilos y la catepsina G, respectivamente.
nota: Si no dispone de un inyector de reactivo, asegúrese de iniciar la lectura lo antes posible después de la adición del indicador a las muestras.
- Inicie la medición del lector de placas y registre el aumento de la relación D/A cada 60-90 segundos durante al menos 20 minutos o hasta que el aumento de la señal alcance una meseta.
- Una vez exportados los datos, se calcula la relación D/A dividiendo las unidades de fluorescencia relativa (RFU) del donante por la RFU del aceptor para cada punto de tiempo y muestra.
- Calcule la relación D/A, la media y la desviación estándar de cada muestra.
- Determine la pendiente dentro del crecimiento lineal del cambio de relación D/A. La pendiente es un indicador de la tasa de escisión de la enzima para una sonda FRET. Calcular la concentración de enzima activa en el esputo ajustando las pendientes de regresión lineal derivadas de las muestras humanas con las calculadas a partir del patrón enzimático.
