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Artículo de método

Ensayo in vitro para medir la actividad de la serina proteasa de neutrófilos mediante un indicador fluorescente

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8 de julio de 2025

En este artículo

Resumen

Fuente: Frey, D. L., et al. Monitorización de la actividad de la elastasa de neutrófilos y la catepsina G en muestras de esputo humano. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un ensayo in vitro para cuantificar la actividad de la serina proteasa de neutrófilos en muestras de esputo. La muestra que contiene la proteasa secretada se incuba con un indicador fluorescente con un motivo de reconocimiento. La escisión del motivo por la proteasa permite la emisión de fluorescencia individual por el fluoróforo donante y aceptor del reportero, lo que indica la actividad de la proteasa en la muestra.

Protocolo

NOTA: Los siguientes protocolos describen la preparación de la muestra y la cuantificación de la actividad de las serina proteasas de neutrófilos (NSPs). Los procedimientos experimentales presentados en este trabajo se centran en la medición de la actividad del esputo humano y la elastasa de neutrófilos (NE) o catepsina G (CG). Sin embargo, ligeras adaptaciones en el protocolo de preparación de muestras hacen posible el análisis de células derivadas de la sangre y homogeneizados tumorales. Además, las actividades de la metaloproteinasa de la matriz y la catepsina S pueden investigarse de forma similar mediante sondas FRET específicas

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Divulgaciones

No se han declarado conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de células de nailon de 100 μmCorning Inc.431752
2300 EnSpire (Lector de placas multietiqueta)PerkinElmer
Plato de 35x10mm, Nunclon DeltaThermo Fisher Scientific150318
Filtro de células de nailon de 40 μmCorning Inc.431750
Tubos de 50 mLSarstedt10535253
equilibrarOHAUS Instruments (Shanghái) Co., Ltd.PR124
BD Falcon Tubos de Fondo Redondo 5 mLBD Biociencia352054
BD LSRFortessa analizador de célulasBD Biociencia
Placa de media área de 96 pozos de fondo plano negroCiencias de la vida de Corning3694
Catepsina GEmpresa de productos de elastinaSG623
Inhibidor de la catepsina G IMerck KGaA219372
centrífuga 5418REppendorf AGEP5401000137
Combitips avanzado 1.0 mLEppendorf AG0030 089 430
Inhibidor completo de la proteinasaRoche11697498001
Elastasa de leucocitos de esputo humanoEmpresa de productos de elastinaSE563
Multipette plusEppendorf AG
NEmo-1SiChemSC-02001 mM
NEmo-2ESiChemSC-02012 mM
Pari Boy SX con un nebulizador de chorro LC SprintPari085G3001
Solución salina tamponada con fosfatoGibco10010-015
ROTI Histokitt (medio de montaje)Carl Roth GmbH + Co.KG6638.1
SalbutamolTeva GmbH
SivelestatProductos químicos de las Islas CaimánAño 17779
EsputolisinaCalbiochem560000-1SET
sSAMEn casa2 mM

Etiquetas

Ensayo de reportero fluorescenteSonda FRETRelación donante-aceptorCurva estándar de la enzimaAnálisis de muestras de esputoExcitación del lector de placasLongitud de onda de emisión de fluorescenciaMedición de la actividad proteasaEnsayo de proteasa in vitro