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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de dispositivos microfluídicos.
- Preparación del ensayo de migración celular microfluídica
- Prepare 50 μg/mL de solución de fibronectina diluyendo 50 μL de solución madre de fibronectina (1 mg/mL) en 950 μL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco dentro de una cabina de bioseguridad.
- Prepare el medio de migración mezclando 9 mL de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) y 1 mL de RPMI-1640 con albúmina sérica bovina (BSA) al 4%.
- Retire el agua desionizada del dispositivo.
- Agregue 100 μL de solución de fibronectina al dispositivo desde la salida. Espere 3 minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos con la solución de fibronectina. Coloque el dispositivo microfluídico en una placa de Petri cubierta durante 1 h a temperatura ambiente.
- Retire la solución de fibronectina del dispositivo. Agregue 100 μL de medio de migración desde la salida. Espere 3 minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos con el medio de migración.
- Incubar el dispositivo durante 1 h más a temperatura ambiente; entonces el dispositivo está listo para el experimento de quimiotaxis.
- Preparación de la solución quimioatrayente para el experimento de quimiotaxis.
- Prepare una solución de fMLP de 100 nM en un medio de migración de 1 mL en total. Mezcle 5 μL de culata FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) con la solución de fMLP en un tubo de 1,5 mL.
nota: FITC-Dextran se utiliza para la medición de gradientes. Alternativamente, use rodamina como indicador de gradiente. La solución quimioatrayente fMLP está lista para el experimento de quimiotaxis.
- Preparación de muestras de esputo.
nota: La quimiotaxis de neutrófilos inducida por un gradiente de muestras de esputo de pacientes con EPOC se probó como una aplicación diagnóstica clínica de este método todo en chip.
- Obtener un protocolo ético humano para recolectar muestras de esputo de pacientes con EPOC.
nota: Obtuvimos aprobaciones para recolectar muestras en el Hospital General Seven Oaks en Winnipeg (aprobado por la Universidad de Manitoba).
- Obtener los formularios de consentimiento informado por escrito de todos los sujetos.
- Recoger muestras espontáneas de esputo de pacientes con EPOC. Coloque una muestra de esputo de 500 μL en un tubo de 1,5 mL.
- Añadir 500 μL de ditiotreitol al 0,1% en el tubo de 1,5 mL y mezclar suavemente. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 15 min.
- Centrifugar la muestra a 753 x g durante 10 min y luego recoger el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante a 865 x g durante 5 min y luego recoger el sobrenadante final. Guarde el sobrenadante recogido dentro de un congelador a -80 °C antes de usarlo.
- Cuando esté listo para el experimento de quimiotaxis, descongele la solución de esputo; transfiera 900 μL de medio de migración a un tubo de 1,5 mL y mezcle con 100 μL de solución de esputo dentro de una cabina de bioseguridad; la solución de esputo estará lista para el experimento de quimiotaxis.
- Toma de muestras de sangre.
- Obtener un protocolo de ética humana para recolectar muestras de sangre de donantes sanos. Obtener los formularios de consentimiento informado por escrito de todos los donantes de sangre.
nota: Aquí, las muestras se obtuvieron en el Hospital General de Victoria en Winnipeg (aprobado por la Junta de Ética de Investigación de la Universidad de Manitoba).
- Recolectar la muestra de sangre por punción venosa y colocar la muestra en un tubo recubierto de EDTA. Mantenga el tubo en una cabina de bioseguridad antes del experimento.
>2. Operación de ensayo de quimiotaxis todo en chip
- Aislamiento de celdas en chip (Figura 1B).
- Coloque 10 μL de sangre entera en un tubo de 1,5 mL dentro de un gabinete de bioseguridad.
nota: Los detalles de la recolección de muestras de sangre se encuentran en la sección 1.4.
- Agregue 2 μL de cóctel de anticuerpos (Ab) y 2 μL de partículas magnéticas (MP) del kit de aislamiento de neutrófilos (consulte la tabla de materiales) en el tubo de 1,5 mL y mezcle suavemente; esto marcará las células en la sangre excepto los neutrófilos.
- Incubar la mezcla de sangre y Ab-MP durante 5 minutos a temperatura ambiente.
nota: Esto marcará magnéticamente las células marcadas con anticuerpos en la sangre.
- Conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados del puerto de carga de la celda del dispositivo. Aspire el medio desde todos los puertos del dispositivo.
- Pipetear lentamente 2 μL de mezcla de sangre y Ab-MP en el dispositivo microfluídico desde el puerto de carga de la celda.
NOTA: Las celdas marcadas magnéticamente quedan atrapadas en las paredes laterales del puerto de carga de la celda, mientras que los neutrófilos fluirán hacia el dispositivo y quedarán atrapados en la estructura de acoplamiento de la celda.
- Espere unos minutos hasta que haya suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento de la célula.
>3. Ensayo de quimiotaxis (Figura 1C).
- Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio con control de temperatura a 37 °C.
- Agregue 100 μL de solución quimioatrayente (fMLP o solución de esputo) y 100 μL de medio de migración a sus depósitos de entrada designados utilizando dos pipetas; esto generará un gradiente de quimioatrayente en el canal de gradiente por mezcla química continua basada en flujo laminar asistida por una estructura de equilibrio de presión.
nota: El detalle de la recolección de esputo de los pacientes con EPOC se encuentra en la sección 1.3.
- Para el experimento de control del medio, solo agregue medio de migración a ambos depósitos de entrada.
- Adquiera la imagen de fluorescencia de FITC-Dextrano en el canal de gradiente.
- Importe la imagen al software ImageJ usando el comando "Archivo|Abierto".
- Mida el perfil de intensidad de fluorescencia a través del canal de gradiente usando el comando "Analizar|Perfil de la parcela".
- Exporte los datos de medición a una hoja de cálculo para su posterior trazado.
- Incubar el dispositivo en la platina de microscopio a temperatura controlada o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 min.
- Visualice el canal de gradiente utilizando un objetivo 10X para registrar las posiciones finales de las celdas para el análisis de datos.
- Si es necesario, registre la migración celular en el dispositivo mediante microscopía de lapso de tiempo.
>4. Análisis de datos de migración celular (Figura 1C)
- Analice el ensayo de quimiotaxis calculando la distancia de migración celular desde la estructura de acoplamiento como se describe a continuación. Véase la figura 1C.
- Importe la imagen en el software NIH ImageJ (versión 1.45).
- Seleccione el centro de cada celda que se movió al canal de degradado.
- Mida las coordenadas de las celdas seleccionadas para sus posiciones finales. Mida la coordenada de un punto en el borde de la estructura de acoplamiento como la posición de referencia inicial.
- Exporte los datos de coordenadas medidos a un software de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel). Calcule la distancia de migración de las celdas como la diferencia entre la posición final de una celda y la posición de referencia inicial a lo largo de la dirección del gradiente.
- Calibra la distancia a un micrómetro. Calcular el promedio y la desviación de la distancia de migración de todas las células como medida de la quimiotaxis.
- Compare la distancia de migración en presencia de un gradiente quimioatrayente con el experimento de control del medio utilizando la prueba t de Student.
- Si se registran las imágenes de lapso de tiempo de la migración celular, la migración celular y la quimiotaxis se pueden analizar más a fondo mediante el análisis de seguimiento celular.
nota: Los materiales necesarios para construir y realizar el ensayo de quimiotaxis todo en chip se detallan en la tabla de materiales.
