Evaluación de la activación de múltiples caspasas en macrófagos

Resumen

Fuente: Han, J. et al., Evaluación de la activación de caspasas para evaluar la muerte de las células inmunitarias innatas.J. Vis. Exp.(2023)

Este video muestra la evaluación de múltiples activaciones de caspasas en macrófagos derivados de la médula ósea a través de la estimulación con el virus de la influenza. Tras la lisis de macrófagos, la inactivación térmica del lisado y la centrifugación, se recogen caspasas intracelulares para su posterior análisis inmunológico.

Protocolo

1. Preparando las soluciones

1. Prepare los medios acondicionados L929.
   1. Placa 1 × 10⁶ células L929 (ver Tabla de Materiales) en un matraz de cultivo de tejidos de 182^cm2 que contiene 50 mL de medio de cultivo L929 (ver Tabla 1 para la preparación del medio).
   2. Cultive las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de dióxido de carbono, CO₂.
   3. Después de 7 días, recoja el sobrenadante y filtre con un filtro de 0,45 μm. Prepare 50 ml de alícuotas (almacene las alícuotas congeladas a -80 °C hasta por 1 año).
2. Prepare 500 mL de medio de cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) (Tabla 1).
3. Prepare 500 mL de medios de estimulación BMDM (Tabla 1).
4. Prepare 500 mL de medio para la infección (Tabla 1).
5. Prepare 100 mL de tampón Tris 1 M (Tabla 1).
6. Prepare 4 veces tampón de dodecil sulfato de sodio (SDS) (Tabla 1).
7. Prepare 1 mL de 1 M de 1,4-ditiotrietol (TDT, Tabla 1).
8. Prepare 40 mL de tampón de lisis de caspasas (Tabla 1).
9. Prepare 100 mL de tampón Tris de 1,5 M (Tabla 1).
10. Prepare 100 mL de una solución SDS al 10% (peso/vol) (Tabla 1).
11. Prepare 50 mL de un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) 2x (Tabla 1).
12. Prepare una solución de lipopolisacárido, LPS de 5 mg/mL (Tabla 1).
13. Prepare una solución de trifosfato de adenosina, ATP de 0,5 M (Tabla 1).
14. Prepara las soluciones de Western blotting.
    1. Prepare 1 L de 5 veces el stock intermedio en funcionamiento (Tabla 1).
    2. Prepare 1 L de 10x stock tampón de transferencia (Tabla 1).
    3. Prepare 1 L de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, Tabla 1).
    4. Prepare 100 mL de una solución bloqueadora de leche descremada al 5% (peso/vol) (Tabla 1).
15. Prepare las soluciones primarias de anticuerpos.
    1. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-1 (Tabla 1).
    2. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-11 (Tabla 1).
    3. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-3 (Tabla 1).
    4. Preparar 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-7 (Tabla 1).
    5. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-8 (Tabla 1).
    6. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de caspasa-9 (Tabla 1).
    7. Prepare 10 mL de anticuerpo primario de β-actina conjugado con HRP (Tabla 1).
16. Prepare las soluciones de anticuerpos secundarios.
    1. Preparar 10 mL de anticuerpo secundario anti-conejo (Tabla 1).
    2. Prepare 10 mL de anticuerpo secundario anti-ratón (Tabla 1).
    3. Prepare 10 mL de anticuerpo secundario anti-rata (Tabla 1).

>2. Aislar macrófagos derivados de la médula ósea

NOTA: Para este protocolo, se pueden utilizar ratones de tipo salvaje de 6 a 10 semanas de edad con vías intactas de muerte celular programada (PCD) o ratones mutantes con los reguladores de PCD, efectores o moléculas de interés eliminados o alterados.

1. Eutanasiar a un ratón en una cámara de CO₂ con un caudal que desplaza entre el 10% y el 30% del volumen de la jaula por minuto durante 2-3 minutos. Luego, realiza un método de eutanasia secundario, como la luxación cervical. Siga todas las pautas y regulaciones adicionales específicas de las instalaciones, instituciones y gobiernos, siempre que corresponda.
2. Disecciona el ratón para recuperar los huesos de las patas traseras.
   1. Sujeta al ratón en su espalda para que el abdomen quede expuesto. Pulverizar con etanol al 70% (vol/vol) para esterilizar las patas traseras y el abdomen.
      cautela: El etanol es inflamable. Manténgalo alejado de llamas abiertas.
   2. Usa tijeras para hacer una incisión en la línea media del abdomen; continúa cortando hacia las piernas para hacer visibles los fémures.
   3. Toma la pierna trasera derecha y aleja la piel del cuerpo hacia la línea media. Separe la pierna del cuerpo cortando los músculos aductores hacia la línea media; Luego, corta la pierna entre la articulación de la cadera y la columna vertebral. A continuación, corte la pata distal al tobillo y elimine el exceso de tejido del hueso despegando la piel y usando unas tijeras ligeramente abiertas para quitar el tejido de la pantorrilla.
   4. Coloque la pierna sobre una toalla empapada en etanol al 70% (vol/vol) y diseccione la tibia y el fémur.
      1. Sujeta la tibia y el fémur, cada uno con un juego de pinzas por separado. Presione suavemente la tibia contra la dirección natural de la articulación de la rodilla; Esto hará que la tibia se rompa a la altura de la rodilla.
      2. Use las pinzas y las tijeras de disección si es necesario para quitar cualquier resto de tejido colgante. Guarde la tibia para usarla más tarde colocándola sobre la toalla empapada en etanol.
      3. Recoge el fémur de la misma manera, rompiendo la rodilla.
   5. Repita los pasos 3 y 4 anteriores para la pierna izquierda para retirarla del cuerpo y diseccionar la tibia y el fémur.
   6. Rocíe los huesos con etanol al 70% (vol/vol).
   7. Limpie los huesos colocándolos sobre una toalla limpia empapada en etanol al 70% (vol/vol), exprimiendo la parte carnosa en la toalla y frotando la toalla contra el hueso para eliminar el exceso de tejido.
3. Una vez que ambos fémures y ambas tibias estén limpios, rocíe los cuatro huesos con etanol al 70% (vol/vol). Recoja los huesos en una placa de Petri estéril y enjuáguelos con 10 mL de medio de cultivo BMDM agitando suavemente el medio en la placa.
4. Llene una jeringa de 10 ml con 10 ml de medio de cultivo BMDM fresco y coloque una aguja de 25 g.
5. Levanta la tibia con pinzas; luego, corta la articulación del tobillo en un ángulo de ~45°.
6. Enjuague la médula ósea de la tibia.
   1. Sostenga la tibia sobre un tubo de 50 ml, con el extremo estrecho de la tibia apuntando hacia abajo. Dispense el medio sobre la tibia desde la jeringa llena.
   2. Inserte la aguja (suavemente al principio) en el extremo superior de la médula y dispense el medio.
   3. Retire la aguja y vuelva a insertarla. Use empujones cortos de alta presión para dispensar el medio y mover la aguja hacia la médula.
   4. Una vez que el medio comience a fluir desde la parte inferior del hueso, use empujes cortos de alta presión para continuar enjuagando las células. Controle el color del hueso durante este proceso, y cuando el hueso esté blanco, deséchelo.
   5. Haz esto para ambas tibias.
7. Repita los pasos 5 y 6 anteriores para los fémures, cortando en la articulación de la cadera como la tibia se cortó en la articulación del tobillo. Utilice el mismo tubo de 50 ml para recoger los medios de cultivo de BMDM a medida que se lava la médula.
8. Una vez que se hayan lavado los cuatro huesos, aspire la médula y los medios del tubo de 50 ml hacia arriba y hacia abajo 3 veces a través de una aguja de 18 g en una jeringa de 10 ml, enjuagando los lados del tubo cada vez para dispersar la médula.
9. Ajuste el volumen final en el tubo de 50 mL a 30 mL con medios de cultivo BMDM y asegúrese de que las células estén completamente suspendidas.
10. Utilice un filtro de células de 70 μm para filtrar los medios de cultivo de BMDM del tubo de 50 mL.
11. Coloque la suspensión celular resultante, que contiene las células progenitoras de la médula ósea, en tres placas de cultivo de tejidos de 150 mm agregando 10 mL (o ~ 20 × 10⁶ células) a cada una. A continuación, añada 10 ml adicionales de medio de cultivo BMDM a cada plato. Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C.

>3. Diferenciación de los BMDMs y el recubrimiento para los experimentos

1. Incubar las células progenitoras de médula ósea en placa a 37 °C durante 3 días. Luego, retire cada plato y agregue 5-8 mL adicionales de medio de cultivo BMDM (Tabla 1). Regrese a la incubadora a 37 °C.
2. El día 5 después del enchapado inicial, retire cada plato y agregue 5 ml adicionales de medio de cultivo BMDM. Regrese a la incubadora a 37 °C.
3. El día 6, retire cada plato y deseche los medios. A continuación, añada 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría (almacenada a 4 °C) para lavar una vez. Deseche los 10 ml de lavado frío de PBS. Luego, agregue 10 ml de PBS fresco y frío a cada plato e incube cada plato en hielo durante 5 minutos.
4. Con un raspador de células, raspe suavemente las células de los tres platos en un tubo de 50 ml. Centrifugar suavemente las células a 270 × g a 4 °C durante 5 min; Luego, desecha el sobrenadante.
5. Agregue 20 mL de medio de cultivo BMDM, pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y cuente las células.
   nota: Se espera que cada ratón produzca aproximadamente 60 × 10 6-100 × 10⁶ celdas.
6. Planifique el diseño de la placa de 12 pocillos para el ensayo de estimulación de la muerte/inflamación celular in vitro deseado. Planifique colocar 1 × 10⁶ celdas por pocillo. Para cada estimulación planificada, incluya al menos tres réplicas biológicas y coloque un conjunto de pozos que se cosecharán en tampón de lisis de caspasas y un segundo conjunto de pozos que se cosecharán en tampón RIPA.
7. Placa 1 × 10⁶ celdas en 1 mL de medio de cultivo BMDM por pocillo en placas de 12 pocillos. Cultivo durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C antes de proceder a la evaluación de muerte celular/inflamación. Después de la incubación durante la noche, retire el medio y agregue 1 ml de PBS tibio (37 °C) a cada pocillo para lavar las células.
8. Retirar el lavado de PBS y añadir 500 μL de medios de estimulación BMDM con antibióticos (si se realizan estimulaciones no bacterianas) o medios de estimulación BMDM sin antibióticos (si se realizan estimulaciones bacterianas) (Tabla 1). Incubar durante 2 h antes de pasar al paso 4 para la estimulación/infección in vitro.

4. Estimulando o infectando las células

>PRECAUCIÓN: Los agentes incluidos en este protocolo son potencialmente patógenos y deben manipularse con las precauciones adecuadas en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con la aprobación de las autoridades institucionales y gubernamentales pertinentes.

1. Estimula los BMDMs para activar la muerte celular con el disparador del interés.
   nota: A los efectos de este protocolo, se utilizan el virus de la gripe A (IAV), el virus del herpes simple 1 (HSV1), la Francisella novicida y el LPS + ATP a título ilustrativo, pero se pueden utilizar otros desencadenantes.
   1. Ejemplo de estimulación 1: Infectar con IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (construido según Hoffmann et al.; el título viral para la determinación de la multiplicidad de la infección [MOI] se calcula mediante un ensayo de placa en células MDCK):
      1. Calcule el volumen de virus necesario para la infección en una multiplicidad de infección (MOI) de 20 unidades formadoras de placas (PFU) utilizando la ecuación (1) y la ecuación (2):
         
         
         
   2. Retire los medios de los BMDM y lave las células una vez con 500 μL de PBS. Agregue 450 μL de IAV (20 MOI) en DMEM de alta glucosa sin suero fetal bovino inactivado por calor, (HI)-FBS a cada pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 1 h en una incubadora humidificada para permitir la absorción.
   3. Retire las placas y añada 50 μL de HI-FBS. Regrese las placas a la incubadora a 37 °C. Incube durante un total de 12 h.

5. Recolección del sobrenadante combinado y el lisado de proteínas que se utilizarán para las transferencias de Western de caspasas

1. Después de 4 h, 12 h o 16 h de incubación (el momento específico depende del gatillo utilizado), retire la placa de la incubadora.
2. Retire 150 μL del sobrenadante; deséchelo o guárdelo para otros análisis de sobrenadante (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA]). No extraiga el sobrenadante restante.
3. Cree la solución de recolección de proteínas combinando 50 μL de tampón de lisis de caspasas + 100 μL de tampón SDS 4x por pocillo (Tabla 1). A continuación, añade 150 μL de la mezcla a cada pocillo.
4. Para cada pocillo, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para recoger las células lisadas y el sobrenadante. Durante el pipeteo, raspe también el fondo del pocillo con la punta de la pipeta para romper las células. Después de raspar y pipetear, recoja el lisado de proteínas en tubos de 1,5 ml marcados.
5. Utilice un bloque de calor para calentar todos los tubos a 100 °C durante 12 minutos.
6. Granular los componentes insolubles centrifugando a 14.500 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
   NOTA: Este es un punto de pausa: la proteína del sobrenadante combinado y los lisados de proteínas se puede usar inmediatamente o almacenar a -20 °C durante un máximo de 2 meses o a -80 °C durante un máximo de 6 meses hasta que esté lista para usar.

categoría	Reactivos	preparación	observaciones	Precauciones de seguridad
Medios	L929 medios de cultura	1) Inactivar el calor FBS (ver observaciones). 2) Combine 43,5 mL de Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), 5 mL de suero fetal bovino inactivado por calor (HI-FBS), 0,5 mL de piruvato de sodio, 0,5 mL de aminoácidos no esenciales y 0,5 mL de penicilina y estreptomicina.	Inactive el calor del FBS incubando a 56 °C durante 30 min.
	Medios de cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM)	Combine 290 mL de IMDM, 150 mL de medios acondicionados L929 y 5 mL de aminoácidos no esenciales, 50 mL de HI-FBS y 5 mL de penicilina y estreptomicina.	Calentar los medios a 37 °C en un baño de agua o perlas antes de usar. Los medios se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
	Medios de estimulación BMDM con antibióticos	Combine 445 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 50 mL de HI-FBS y 5 mL de penicilina y estreptomicina.	Calentar los medios a 37 °C en un baño de agua o perlas antes de usar. Los medios se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
	Medios de estimulación BMDM sin antibióticos	Combine 450 mL de DMEM y 50 mL de HI-FBS.	Calentar los medios a 37 °C en un baño de agua o perlas antes de usar. Los medios se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
	Medios para la infección (sin HI-FBS)	Combine 495 mL de DMEM de alta glucosa con 5 mL de penicilina y estreptomicina.	Calentar los medios a 37 °C en un baño de agua o perlas antes de usar. Los medios se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
Tampón de dodecil sulfato de sodio (SDS)	1 M Tampón Tris (para búfer SDS 4x)	1) Disolver 12,11 g de Tris en 80 mL de agua desionizada. 2) Ajuste el pH a 6.8 agregando gotas de HCl mientras revuelve. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 100 mL.	El tampón puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.	El HCl es cáustico. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. El HCl debe manipularse en una campana extractora.
	4 búferes SDS	1) Combine 60 mL de solución de Tris (pH 6.8) de 1 M, 24 mg de SDS, 100 mg de azul de bromofenol, 120 mL de glicerol, 8.4 mL de β-mercaptoetanol (BME) y 90 mL de agua desionizada. 2) Revuelva en una placa de agitación para permitir que las sales entren en la solución. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 300 mL.	El tampón puede alícuota y almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año.	El SDS es cáustico y el BME es cancerígeno. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. SDS y BME deben manipularse en una campana extractora.
Tampón de lisis de caspasas	1 M 1,4-ditiotreitol (DTT)	Disuelva 0,154 g de polvo de DTT en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Permita que la TDT entre en la solución.	El tampón puede alícuota en alícuotas de 200 μL y almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año.
	Tampón de lisis de caspasas	Combine 35 mL de agua desionizada, 4 mL de NP-40, 750 μL de DTT 1 M, 1 tableta de inhibidor de la proteasa y 1 tableta de inhibidor de la fosfatasa.	El tampón puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
Tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)	1,5 M Tampón Tris (para el tampón RIPA)	1) Disolver 18,2 g de Tris en 80 mL de agua desionizada. 2) Ajuste el pH a 8.8 agregando gotas de NaOH mientras revuelve. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 100 mL.	El tampón puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.	El NaOH es corrosivo y puede causar quemaduras. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes.
	10% (peso en peso/vol) Solución SDS (para el tampón RIPA)	1) Añadir 10 g de SDS a 80 mL de agua desionizada. 2) Revuelva hasta que se disuelva. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 100 mL.	La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses. Si la solución precipita, caliéntelo suavemente para volver a disolver.	El SDS es cáustico. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. El SDS debe manipularse en una campana extractora.
	Búfer RIPA (2x culata)	1) Combine 0,5 g de desoxicolato de sodio, 1 mL de NP-40, 0,876 g de NaCl, 3,3 mL de 1,5 M Tris (pH 8,8) y 1 mL de SDS al 10% (peso/vol) en 46 mL de agua desionizada. 2) Revuelva hasta que se disuelva. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 50 mL.	2 existencias de RIPA se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.	El SDS es cáustico. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. El SDS debe manipularse en una campana extractora.
Disparadores estériles	Lps	Disuelva el LPS liofilizado de E. coli 0111:B4 en agua libre de endotoxinas hasta una concentración de 5 mg/mL.	La solución puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 2 años.
	0,5 m ATP	Disuelve 1 g de ATP liofilizado en 3,63 mL de agua libre de endotoxinas.	La solución puede alícuota y almacenarse a -20 °C durante un máximo de 2 años.
Soluciones de Western blot	Búfer en ejecución (5x culata)	1) Combine 15 g de Tris base, 72 g de glicina y 5 g de SDS en 900 mL de agua desionizada. 2) Revuelva hasta que no queden partículas. 3) Añadir agua desionizada para ajustar el volumen final a 1 L.	El tampón se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses.	El SDS es cáustico. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. El SDS debe manipularse en una campana extractora.
	Búfer de transferencia (10x culata)	1) Combine 30,3 g de base Tris y 72 g de glicina en 900 mL de agua desionizada. 2) Revuelva hasta que no queden partículas. 3) Añadir agua desionizada para ajustar el volumen final a 1 L.	El tampón se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 3 meses.
	Solución salina tamponada Tris con Tween 20 (TBST)	1) Disolver 2,42 g de Tris base y 8,76 g de NaCl en 850 mL de agua desionizada. 2) Ajuste el pH a 7.4 agregando gotas de HCl mientras revuelve. 3) Agregue agua desionizada para ajustar el volumen final a 1 L. 4) Añadir 0,5 mL de Tween 20 (concentración final de 0,05% (vol/vol)).	La solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes.	El HCl es cáustico. Use siempre el equipo de protección personal adecuado; Esto incluirá una bata de laboratorio y guantes. El HCl debe manipularse en una campana extractora.
	5% (peso/vol) de solución bloqueadora de leche descremada	Disuelva 5 g de leche en polvo descremada en 100 ml de TBST.	La solución puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
Anticuerpos primarios	Anticuerpo primario de caspasa-1	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-1 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL del anticuerpo a 10 mL de solución bloqueante de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario caspasa-11	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-11 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL del anticuerpo a 10 ml de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario de caspasa-3	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-3 y el anticuerpo anti-caspasa-3 escindido 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL de cada anticuerpo a los mismos 10 mL de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario de caspasa-7	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-7 y el anticuerpo anti-caspasa-7 escindido 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL de cada anticuerpo a los mismos 10 mL de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario caspasa-8	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-8 y el anticuerpo anti-caspasa-8 escindido 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL de cada anticuerpo a los mismos 10 mL de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario de caspasa-9	Diluir el anticuerpo anti-caspasa-9 1:1.000 (vol/vol) añadiendo 10 μL del anticuerpo a 10 mL de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Para obtener resultados óptimos, hágalo fresco para cada experimento. Sin embargo, esta solución se puede usar al menos 3 veces sin pérdida de efectividad. Almacenar a -20 °C si se reutiliza.
	Anticuerpo primario de β-actina conjugado con HRP	Diluir el anticuerpo anti-β-actina 1:5.000 (vol/vol) añadiendo 2 μL del anticuerpo a 10 mL de solución bloqueante de leche desnatada al 5% (peso/vol).	Este anticuerpo debe prepararse fresco para cada experimento.
Anticuerpos secundarios	Anticuerpo anti-conejo	Diluir el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) 1:5.000 (vol:vol) añadiendo 2 μL del anticuerpo a 10 ml de solución bloqueadora de leche desnatada al 5% (peso/vol).	La dilución de anticuerpos debe prepararse fresca cada vez.
	Anticuerpo anti-ratón	Diluir el anticuerpo secundario conjugado con HRP 1:5.000 (vol:vol) añadiendo 2 μL del anticuerpo a 10 mL de solución bloqueante de leche desnatada al 5% (peso/vol).	La dilución de anticuerpos debe prepararse fresca cada vez.
	Anticuerpo anti-ratas	Diluir el anticuerpo secundario conjugado con HRP 1:5.000 (vol:vol) añadiendo 2 μL del anticuerpo a 10 mL de solución bloqueante de leche desnatada al 5% (peso/vol).	La dilución de anticuerpos debe prepararse fresca cada vez.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de 0,45 μm	Millipore	SCHVU05RE
Jeringa de 10 mL	BD Biociencias	309604
Placa de 12 pocillos	Corning	07-200-82
Aguja de 18 G	BD Biociencias	305195
Aguja de 25 g	BD Biociencias	305122
Tubo de 50 mL	Fisher Científico	50-809-218
Filtro de células de 70 μm	Corning	431751
Placas de cultivo de tejidos de 150 mm	Corning	430597
Matraz de cultivo de tejidos de 182 cm2	Genesee Científico	25-211
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
Caldo de soja BBL Trypticase	BD Biociencias	211768
Baño de cuentas	Ciencias de la vida de Chemglass	CLS-4598-009
Biofotómetro D30	Eppendorf	6133000010
Raspadores de células	Productos científicos CellTreat	229315
Cámara de CO2	VetEquip	901703
Cubetas	Fisher Científico	Teléfono 14-955-129
Tijeras de disección	Thermo Fisher Scientific	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995-073
etanol	Farmacia	111000200
Suero fetal bovino	Biooeste	S1620
Papel de filtro	Bio-Rad	1703965
fórceps	Fisher Científico	22-327379
Francisella novicida (cepa U112)	Recursos de BEI	NR-13
Gentamicina	Gibco	15750060
Bloque de calor	Fisher Científico	23-043-160
Virus del herpes simple 1 (cepa HF)	ATCC	VR-260
DMEM de glucosa alta	sigma	D6171
Incubadora humidificada	Thermo Fisher Scientific	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientific	12440-053
Virus de la influenza A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	construido por Hoffmann et al.
Células L929	ATCC	CCL-1	Línea celular para la creación de medios acondicionados L929
L-cisteína	Thermo Fisher Scientific	BP376-100
Células MDCK	ATCC	CCL-34	Línea celular para determinar el título viral de IAV
Microcentrífuga	Thermo Fisher Scientific	75002401
Aminoácidos no esenciales	Gibco	11140050
Solución NP-40	sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicilina y estreptomicina	sigma	P4333
placa de Petri	Fisher Científico	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Fuente de alimentación	Bio-Rad	164-5052
Comprimido inhibidor de la proteasa	sigma	S8820
hidróxido sódico	sigma	72068
Piruvato de sodio	Gibco	11360-070
Placa de Petri cuadrada	Fisher Científico	FB0875711A
Centrífuga de sobremesa	Thermo Fisher Scientific	75004524
Lipopolisacárido ultrapuro (LPS) de E. coli 0111:B4	InvivoGen	tlrl-3pelps
Células Vero	ATCC	CCL-81	Línea celular para determinar el título viral de HSV1