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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Análisis de citocinas lagrimales
- Recogida de lágrimas:
- Pida al sujeto que se siente cómodamente en una silla de examen y que apoye la cabeza en el reposacabezas.
- Pida al sujeto que mire hacia arriba, abra cuidadosamente las tiras de Schirmer (hechas de papel de filtro Whatman nº 41), coloque el extremo redondeado de la tira en el fórnix inferior del ojo e indique al sujeto que cierre los ojos durante 5 minutos. Al recoger las lágrimas, tenga mucho cuidado de minimizar el contacto con la superficie ocular.
- Pida al sujeto que abra los ojos para retirar la tira y colocarla en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Transfiera inmediatamente el tubo al laboratorio o guárdelo a -80 oC hasta que se realice la prueba de perfil de citocinas.
- Elución de la muestra de lágrima a partir de la tira de flujo lagrimal:
- Corte la tira de flujo lagrimal a una longitud de 0,5 cm (para estandarizar la cantidad de lágrimas que se van a analizar) y colóquela en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
- Añadir 30 μL de tampón de ensayo e incubar a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de centrifugar el tubo a 14.000 x g durante 1 min.
- Transfiera el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y deseche la tira. Coloque la muestra que contiene el tubo en hielo y utilice la muestra lagrimal eluida inmediatamente para el perfil de citocinas.
- Preparación de reactivos:
NOTA: Los cuarenta y un analitos que se analizarán en cada muestra mediante un ensayo multiplex basado en perlas son interleucina (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferón alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, proteína inducible por IFN-gamma 10 (IP-10, CXCL10), quimiocina derivada de macrófagos (MDC), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α y MIP-1β, proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-1, MCP-3, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), TNF-β, oncogén regulado por el crecimiento (GRO), factor de crecimiento tumoral alfa (TGF-α), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), eotaxina, fractalkina, ligando CD40 soluble (sCD40L), ligando 3 de tirosina quinasa similar a Fms (Flt-3L) y regulado tras la activación, proteína normal expresada y secretada por células T (RANTES).
- Lleve los viales de solución de perlas de anticuerpos (50X) a temperatura ambiente (20 – 25 oC) y agite los viales durante 1 min.
- Cuente el número de pocillos necesarios para el ensayo y calcule la cantidad de solución total de cóctel de perlas de anticuerpos (25 μL por pocillo) y cada solución de perlas de anticuerpos (50X) necesarias para el ensayo.
- Prepare la solución de cóctel añadiendo la cantidad calculada de cada solución de perlas de anticuerpos y llénela hasta el volumen final deseado añadiendo la cantidad restante de diluyente de perlas. Asegúrese de que la concentración final de cada anticuerpo en el cóctel sea 1X. Prepare siempre al menos un 20% de volumen adicional de solución de cóctel en caso de errores de pipeteo.
nota: Por ejemplo, para un ensayo de 96 pocillos, prepare 3000 μL de solución de cóctel de perlas de anticuerpos. La cantidad requerida de cada solución de perlas de anticuerpos = 3000/concentración de existencias de cada solución de perlas de anticuerpos; 3000/50 = 60 μL de cada solución de perlas de anticuerpos
- Agregue 60 μL de cada una de las 41 soluciones de perlas de anticuerpos (60 X 41 = 2460 μL) en una botella de cóctel y agregue 540 μL de solución diluyente de perlas a la mezcla de perlas de anticuerpos para hacer 3000 μL de solución de trabajo final (1X).
- Antes de usar, mezcle bien la solución de cóctel de perlas. Después del ensayo, almacene el volumen restante a 2-8 oC durante un máximo de 30 días.
- Prepare los controles de calidad (QC) agregando 250 μL de agua desionizada a las existencias de QC 1 y QC 2.
- Mezcle correctamente invirtiendo las botellas varias veces y agitando en vórtice durante 10 segundos. Transfiera la solución a tubos de microcentrífuga de polipropileno debidamente etiquetados y almacene la solución restante a -20 oC, que se puede utilizar hasta por 30 días.
- Prepare el tampón de lavado agregando 270 mL de agua desionizada a 30 mL de solución tampón de lavado 10X y mezcle bien (antes de la dilución, lleve el tampón 10X a temperatura ambiente y disuelva todos los precipitados de sal mezclando). Guarde el tampón de lavado sin usar (1X) a 2-8 oC, que se puede utilizar hasta 30 días.
- Prepare el stock estándar de citocinas humanas (10.000 pg/mL de todos los analitos) añadiendo 250 μL de agua desionizada al vial madre. Mezclar bien invirtiendo varias veces y agitando el vial durante 10 segundos. Déjelo reposar durante 10 minutos y transfiera la solución madre a tubos de microcentrífuga de polipropileno debidamente etiquetados. Después del ensayo, almacene la solución restante a -20 oC, que puede utilizarse hasta 30 días.
- Prepare los patrones de citocinas humanas de trabajo mediante diluciones en serie 5 veces (50 μL > 200 μL) con tampón de ensayo para obtener 2000, 400, 80, 16 y 3,2 pg/mL.
- Después de la preparación estándar, utilice los estándares de trabajo dentro de los 60 minutos y utilice el tampón de ensayo como blanco/fondo (-pg/mL).
- Perfilado de citocinas mediante ensayo multiplex basado en perlas:
- Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y vórtice durante 5-10 segundos antes de agregarlos a la placa de microtitulación de 96 pocillos. Si las muestras de lágrimas eluidas se almacenan a -80 °C antes del ensayo, descongele los extractos de lágrimas congelados en hielo y centrifugue a 1000 X g durante 5 minutos.
- Prepare una hoja de trabajo de ensayo en una configuración vertical para trabajar con patrones de citocinas humanas [0 (en blanco), 3,2, 16, 80, 400, 2.000 y 10.000 pg/mL], QC1, QC2 y muestras.
- Añadir 200 μL de tampón de lavado 1X a cada pocillo de la placa, sellarla con un sellador de placas y mantenerla en un agitador de placas a temperatura ambiente (20-25 oC) durante 10 min.
- Decanta el tampón de lavado 1X invirtiendo la placa y pegándola con cinta adhesiva en toallas absorbentes varias veces para eliminar cualquier cantidad residual de tampón de lavado en los pocillos.
- Agregue 25 μL de cada patrón de citocinas humanas en funcionamiento, QC1, QC2, blanco (tampón de ensayo) y muestras en los pocillos apropiados.
- Agregue 25 μL de tampón de ensayo en cada pocillo.
- Agregue 25 μL de solución de cóctel de perlas de anticuerpos 1X en cada pocillo. Como la solución de perlas de anticuerpos es sensible a la luz, selle la placa con un sellador de placas y cúbrala con papel de aluminio para protegerla de la luz durante el ensayo.
- Incubar la placa a 4 oC durante la noche en un agitador.
- Coloque la placa en la rejilla de placas de una lavadora de placas magnética automática. Déjelo reposar durante 1 minuto para asentar las perlas magnéticas en el fondo del pocillo y aspirar el contenido del pocillo. Añadir 200 μL de tampón de lavado por pocillo, dejar reposar durante 1 min y luego aspirar el contenido del pocillo. Repita el lavado una vez más (para lavar la placa, siga las instrucciones del fabricante del kit).
- Agregue 25 μL de solución de anticuerpos de detección en cada pocillo, selle la placa, cúbrala con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 60 minutos en un agitador.
- Agregue 25 μL de solución de estreptavidina-ficoeritrina en cada pocillo, selle la placa, cúbrala con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador.
- Coloque la placa en una arandela de placa magnética. Déjelo reposar durante 1 minuto y luego aspire el contenido del pozo. Añadir 200 μL de tampón de lavado por pocillo. Déjelo reposar durante 1 minuto y luego aspire el contenido del pozo. Repite el lavado una vez más.
- Agregue 150 μL de líquido de la vaina a cada pocillo y coloque la placa en un agitador durante 5 min a temperatura ambiente para resuspender las perlas de anticuerpos.
- Lea la placa inmediatamente utilizando el lector de placas de ensayo multiplex basado en perlas y analice las concentraciones de citocinas utilizando un algoritmo de ajuste de curva de 5 parámetros. En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo esquemático del perfil de citocinas lagrimales.
- Lectura de la placa de ensayo (configuración del instrumento) y análisis de datos:
- Encienda el lector de ensayos multiplex basado en perlas y precaliente el láser durante 30 minutos.
- Inicie el software de ensayo múltiplex basado en perlas. En la pestaña 'Mantenimiento automatizado', seleccione la opción 'Calibración-verificación'. Agite cada vial de reactivo de las perlas de calibración y verificación durante 30 segundos. Coloque 5 gotas de cada reactivo en los pocillos designados. Llene los depósitos designados con agua desionizada y etanol al 70%.
