Uso de la hibridación in situ de fluorescencia de inmunoARN para visualizar el SARS-CoV-2

1. ARN-FISH del SARS-CoV-2 en células Vero cultivadas en cubreobjetos

>DÍA 1

1. Fijación y permeabilización de células
   1. Fije las células infectadas con una solución de PFA al 3,7% p/v durante 1 h en RT.
   2. Aspire la solución de PFA al 3,7% y lave las células dos veces con 1x PBS.
   3. Permeabilizar las células con solución de PBST durante 10 min a RT con agitación.
   4. Aspire el PBST y lave las celdas dos veces con 1x PBS.
2. detección
   1. Aspire la solución 1x PBS y lave las celdas dos veces con 2x SSC en RT.
   2. Aspire la solución 2x SSC y prehibridar las muestras añadiendo al menos 300 μL de tampón de hibridación de sonda. Cubra los pocillos que contienen las células e incube a 37 °C durante 30 min.
   3. Prepare la solución de la sonda añadiendo 1,2 pmol de mezcla de sonda al tampón de hibridación de la sonda.
      1. Utilice 1,2 μL del material de la sonda de 1 μM para preparar 300 μL de material de trabajo.
   4. Retire la solución de prehibridación y transfiera los cubreobjetos a una cámara humidificada.
      1. Pipetear 30-50 μL de solución de sonda en el parafilm para formar gotas individuales.
   5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) a 37 °C.

>DÍA 2

1. Transfiera los cubreobjetos a una placa de 12 pocillos y elimine el exceso de solución de la sonda lavándola durante 4 x 5 min con 400 μL de tampón de lavado de la sonda a 37 °C.
   nota: Como alternativa a la colocación de alícuotas de 30-50 μl en el parafilm y debajo de los cubreobjetos para la incubación, agregue 300 μL de solución de sonda directamente a los cubreobjetos en una placa de 12 pocillos. Este procedimiento es más sencillo, pero requiere cantidades sustanciales de reactivos. Calentar el tampón de lavado de la sonda a 37 °C antes de usarlo. Calcule la cantidad de tampón necesaria y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
2. Lave las muestras durante 2 x 5 min con 5x SSCT en RT.
3. Sustituya la solución de 5x SSCT por 1x PBS y almacene las muestras a 4 °C hasta la amplificación.

3. Amplificación

1. Retire la solución 1x PBS de los pocillos y agregue al menos 300 μL de tampón de amplificación a cada pocillo. Incubar las muestras durante 30 minutos en RT.
2. Prepare cada horquilla HCR (h1 y h2) enfriando a presión el volumen deseado en tubos separados.
   1. Para preparar 300 μL de solución de amplificación, use 18 pmol de cada horquilla (por ejemplo, para 300 μL, use 6 μL de una solución de horquilla de 3 μM).
   2. Transfiera la solución de horquilla a tubos.
   3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
   4. Deje enfriar a RT durante 30 minutos en la oscuridad.
3. Prepare una mezcla de horquillas añadiendo las horquillas "h1" y "h2" enfriadas a presión al búfer de amplificación.
4. Coloque gotas de 30-50 μL de mezcla de horquilla en el parafilm.
5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) en la oscuridad a RT.

>DÍA 3

6. Transfiera los cubreobjetos nuevamente a la placa de 12 pocillos y elimine el exceso de horquillas lavando durante 5 x 5 minutos con 5x SSCT en RT con agitación.
7. Aspire el tampón SSCT 5x y reemplácelo con 1x PBS.
   nota: Si es necesario, utilice las muestras de ARN-FISH en un ensayo de inmunofluorescencia estándar, seguido de la tinción de los núcleos (ver sección 1.4).

>4. Tinción nuclear y montaje de portaobjetos

1. Aspire la solución 1x PBS y reemplácela con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,2 μg/mL) en 1x solución PBS.
2. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT en la oscuridad.
3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
4. Coloque dos gotas de 10 μL cada una de medio de montaje; asegúrese de que las gotas estén separadas lo suficiente como para permitir que se coloquen dos cubreobjetos en un solo portaobjetos.
5. Elimine el exceso de líquido golpeando los cubreobjetos con una toalla limpia y luego colóquelos en un medio de montaje antidecoloración con las celdas hacia abajo.
6. Coloque las muestras montadas sobre una superficie seca y plana en la oscuridad y déjelas curar.
7. Después del curado, selle los bordes de los cubreobjetos con sellador VALAP o esmalte de uñas para evitar que las muestras se sequen.

>2. SARS-CoV-2 RNA-FISH en cultivos de AEH

>DÍA 1

1. Fijación y permeabilidad del cultivo del AEH
   1. Aspire el medio y fije las células infectadas con una solución de PFA al 3,7% durante 1 h en RT.
   2. Aspire la solución de PFA al 3,7% y lave las células dos veces con 1x PBS.
      1. Reemplace la solución de PFA al 3,7% con 1x PBS debajo de un inserto Transwell.
   3. Deseche el PBS y deshidrate las muestras con lavados de 2 x 5 min con MeOH al 100% preenfriado a -20 °C.
   4. Después del segundo lavado, reemplace el tampón con MeOH fresco y enfriado para la permeabilización debajo del inserto Transwell. Almacenar durante la noche a -20 °C.

>DÍA 2

2. Rehidratación
   Rehidrate las muestras a través de una serie graduada de soluciones de MeOH/PBST (cada una durante 5 minutos) en hielo: 75 % de MeOH/25 % de PBST, 50 % de MeOH/50 % de PBST, 25 % de MeOH/75 % de PBTS y 100 % de PBST (dos veces).
   1. Lave las celdas durante 5 minutos con hielo con 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Lave las celdas durante 5 minutos con hielo con 5x SSCT.
   3. Reemplace el búfer SSCT 5x por 1x PBS.
3. detección
   1. Incubar las células (dentro del inserto Transwell) durante 5 min en hielo con 100 μL de tampón de hibridación de sonda. A continuación, transfiera la placa a una incubadora durante 30 minutos a 37 °C (prehibridación).
      nota: El tampón de hibridación de la sonda debe precalentarse a 37 °C antes de su uso. Calcule el volumen requerido: se necesitan 100 μL para un solo inserto Transwell.
   2. Prepare la solución de la sonda. Como 1 mL de solución de sonda requiere 4 pmol de sonda, agregue 4 μL de solución madre de sonda de 1 μM a 1 mL de tampón de hibridación de sonda y mezcle bien><. nota: Para la detección de ARN, utilice 100 μL de solución de sonda por inserto Transwell. Deje la solución de la sonda en hielo hasta el final de la etapa de prehibridación.
   3. Retire la solución de prehibridación y agregue la solución de sonda.
   4. Incubar las células durante la noche (12-18 h) a 37 °C.

>DÍA 3

5. Elimine el exceso de sonda lavando durante 4 x 15 min con 100 μL de tampón de lavado de la sonda a 37 °C.
6. Lave las muestras durante 2 x 5 min con 5x SSCT en RT.
7. Sustituya el 5x SSCT por 1x PBS, y almacene las muestras a 4 °C hasta la amplificación.

4. amplificación

1. Preamplificar las muestras incubándolas con un tampón de amplificación durante 30 min en RT.
2. Prepare cada horquilla enfriando rápidamente los volúmenes deseados en tubos separados.
   1. Para preparar 500 μL de solución de amplificación, use 30 pmol de cada horquilla (por ejemplo, para 500 μL, use 10 μL de solución de horquilla madre de 3 μM).
   2. Transfiera la solución de horquilla a los tubos.
   3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
   4. Deje enfriar a RT durante 30 minutos en la oscuridad.
3. Prepare la solución de horquilla añadiendo todas las horquillas enfriadas a presión a 500 μL de tampón de amplificación en RT.
4. Retire la solución de preamplificación y agregue la solución de horquilla completa.
5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) en RT en la oscuridad.
6. Elimine el exceso de horquillas lavando con 5x SSCT en RT de la siguiente manera: 2 x 5 min, 2 x 15 min y 1 x 5 min.
7. Reemplace la solución de SSCT 5x por 1x PBS, y almacene a 4 °C durante no más de 2-3 días, o proceda directamente a la tinción nuclear.
   nota: Si es necesario, utilice las muestras de ARN-FISH en un ensayo de inmunofluorescencia estándar, seguido de una tinción nuclear (ver sección 3).

>5. Tinción nuclear y montaje de portaobjetos

1. Aspire la solución 1x PBS y reemplácela con la solución DAPI (0,2 μg/mL) en 1x PBS.
2. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT en la oscuridad.
3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
4. Coloque la membrana recortada de los insertos Transwell en 10 μL de medio de montaje antidecoloración con las celdas hacia arriba y agregue medio de montaje adicional (5 μL) a la membrana.
5. Cubra las membranas con cubreobjetos.
6. Cura las muestras montadas en una superficie seca y plana en la oscuridad.
7. Después del curado, selle los bordes de los cubreobjetos con sellador VALAP o esmalte de uñas para evitar que las muestras se sequen.

>3. Análisis de inmunofluorescencia de células Vero y cultivos de AEH

NOTA: Realice el ensayo de inmunofluorescencia el día 3 para líneas celulares o el día 4 para cultivos de AEH. Utilice un enfoque diferente para cada modelo. Todas las diferencias se indican claramente.

1. Aspire la solución 1x PBS de los pozos.
2. Bloquear las muestras por incubación con albúmina sérica bovina al 1% p/v en solución de PBST durante 30 min a 37 °C.
3. Preparar los anticuerpos primarios preparando las diluciones adecuadas en solución bloqueante e incubar.
   1. Para las celdas Vero en cubreobjetos:
      1. Coloque gotas (30-50 μL) de solución de anticuerpos en el parafilm en una cámara de humedad.
      2. Coloque los cubreobjetos en las gotas de anticuerpos con las células hacia abajo.
   2. Para AEH, reemplace el agente bloqueante en los insertos con solución de anticuerpos (100 μL) e incube las muestras en una cámara humidificada.
      NOTA: Ajuste el tiempo y la temperatura para cada incubación con el anticuerpo primario. Los parámetros típicos son 2 h a RT o toda la noche a 4 °C.
4. Lave las muestras durante 3 x 5 min con PBST.
   1. En el caso de las celdas en cubreobjetos, transfiéralas a una placa de 12 pocillos y agregue la solución de PBST.
   2. En el caso de los cultivos de AEH, sustituya la solución de anticuerpos por la solución PBST.
5. Compruebe las fuentes de luz y los filtros disponibles para el microscopio confocal.
6. Elija anticuerpos secundarios de acuerdo con la especie huésped. Elija los parámetros del fluoróforo (longitudes de onda de excitación y emisión, ancho de espectro y eficiencia de excitación de acuerdo con la fuente de luz disponible).
   nota: Los parámetros espectrales se pueden modelar utilizando herramientas en línea (ver Tabla de Materiales).
7. Prepare las soluciones de anticuerpos secundarios adecuadas diluyéndolas con una solución bloqueante.
8. Incubar con anticuerpos secundarios (como en 6.3), pero incubar durante 1 h a 37 °C.
9. Lave las muestras como en el paso 3.4.
10. Tinción nuclear y montaje de portaobjetos
    1. Para celdas en cubreobjetos
       1. Aspire el PBST y reemplácelo con DAPI (0,2 μg/mL) en 1x solución de PBS.
       2. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT en la oscuridad.
       3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
       4. Coloque los cubreobjetos sobre gotas de 10 μL de medio de montaje con las celdas hacia abajo.
       5. Sella los cubreobjetos con esmalte de uñas.
    2. Para los cultivos de AEH
       1. Aspire el 1x PBST y reemplácelo con DAPI (0,2 μg/mL) en 1x solución de PBS.
       2. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT en la oscuridad.
       3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
       4. Coloque las membranas recortadas sobre gotas de 10 μL de medio de montaje con las células hacia arriba y agregue un medio de montaje adicional (5 μL) a la membrana.
       5. Cubra las membranas con cubreobjetos.
       6. Sella los cubreobjetos con esmalte de uñas.

>4. Microscopía confocal

1. Defina las pistas especificando los fluoróforos utilizados.
2. Elija el modo de escaneo y la velocidad.
3. Ajuste los valores de potencia, ganancia y compensación del láser para cada fluoróforo comparándolos con los respectivos controles negativos: para virus, células infectadas simuladas; para proteínas celulares, muestras teñidas con anticuerpos de control de isotipo de un huésped apropiado.
4. Para adquirir una imagen 3D, active el modo z-stack y establezca los límites superior e inferior. Establezca el tamaño/número del paso.
   nota: Para obtener más detalles sobre las imágenes del coronavirus.