Un ensayo de microneutralización para medir los títulos de anticuerpos neutralizantes en el suero humano

Resumen

Fuente: Gross, F. L. et al., Medición de las respuestas de anticuerpos neutralizantes de la influenza a los virus A(H3N2) en sueros humanos mediante ensayos de microneutralización utilizando células MDCK-SIAT1.J. Vis. Exp.(2017)

Este video muestra ensayos de microneutralización para medir anticuerpos neutralizantes utilizando células de riñón canino Madin-Darby que sobreexpresan ácido siálico ligado a α2,6 en sueros humanos. Este ensayo se utiliza a menudo para la serología humana de la influenza

Protocolo

Todos los virus de la influenza deben manipularse de acuerdo con los requisitos de nivel de bioseguridad apropiados (BSL-2 o superior) según se define en la Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos (BMBL).

1. Preparación de reactivos y material de partida

1. Preparación de células de riñón canino Madine Darby α2,6-sial transferasa (MDCK-SIAT1) y medio de cultivo celular estéril
   1. Prepare el medio de cultivo celular MDCK-SIAT1 utilizando 500 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa, 10% v/v de suero fetal bovino (FBS) inactivado por cal....

Resultados

Figura 1. Cultivo celular MDCK-SIAT1.Células MDCK-SIAT1. (A) MDCK-SIAT1 monocapa confluente (>100% de confluencia) para la inoculación del virus; (B) Células MDCK-SIAT1 en fase logarítmica con 75 - 95% de confluencia para ensayos TCID₅₀ y MN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa	Ciencias de la Vida	Año 11965	Un componente crítico del cultivo de células estériles, la propagación de virus y los medios diluyentes de virus
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Albúmina sérica bovina (BSA) fracción V, libre de protasa	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamina	Ciencias de la Vida	25030-081
Piruvato de sodio	Ciencias de la Vida	11360-070
Genética G-418 sal de disulfato	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Ciencias de la Vida	15630-080
Penicilina/Estreptomicina	Ciencias de la Vida	Números 15140-122
acetona	VWR	67-64-1	Se utiliza en una concentración del 80%
Tampón de fosfato-citrato con perborato de sodio	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
Tableta de diclorhidrato de O-fenilendiamina	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 comprimido por cada 100 ml de agua apta para cultivo celular
ácido sulfúrico	Fisher Científico	A510-P500	Concentración final utilizada de 0,5 m
Etanol, Desnaturalizado, 4L	VWR	EM-AX0422-3	Se utiliza en una concentración del 70%
Tripsina-EDTA	Ciencias de la Vida	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Preadolescente 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Ab monoclonal de ratón anti-NP	Piscina Millipore	MAB 8257 MAB 8258
IgG HRP antiratón	KPL	074-1802
Placas de fondo plano de 96 pocillos	Termo Científico	3455
Lector de placas	Dispositivo molecular	Spectromax 384 plus
Matraz de cultivo celular 162 cm2/Tapón de ventilación	Corning/VWR	3151