Todos los virus de la influenza deben manipularse de acuerdo con los requisitos de nivel de bioseguridad apropiados (BSL-2 o superior) según se define en la Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos (BMBL).
1. Preparación de reactivos y material de partida
- Preparación de células de riñón canino Madine Darby α2,6-sial transferasa (MDCK-SIAT1) y medio de cultivo celular estéril
- Prepare el medio de cultivo celular MDCK-SIAT1 utilizando 500 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa, 10% v/v de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mg/mL de sulfato G418 (por ejemplo, genética) y 100 U/ml de penicilina con 100 μg/mL de estreptomicina (opcional). Esterilizar por filtración a través de una membrana de tamaño de poro de 0,2 μM. Se añade sulfato G418 para garantizar la estabilidad del plásmido en las células MDCK-SIAT1.
- Prepare la línea celular MDCK-SIAT1. En un matraz o matraces de cultivo de tejidos de162 cm2 que contengan 30 ml de medios de cultivo celular estériles, los matraces de semillas con 2 células MDCK-SIAT1 de 2,5 x 106 se incuban a 37 °C con CO2 al 5% durante 2 días; esto se utilizará para la determinación de dosis infecciosas en cultivo de tejidos (TCID) y ensayos de MN.
nota: Las células MDCK-SIAT1 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. M. Matrosovich, Marburgo, Alemania. Esta línea celular también se puede obtener comercialmente (ver la Tabla de Materiales).
- Prepare el medio de propagación del virus estéril utilizando 500 mL de DMEM con alto contenido de glucosa, 0,3% de fracción V de albúmina sérica bovina (BSA), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 20 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES). Esterilizar por filtración a través de una membrana de tamaño de poro de 0,2 μM.
- Prepare glóbulos rojos de conejillo de indias al 0,75% (v/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,01 M de PBS, a pH 7,2.
- Prepare el diluyente estéril del virus con DMEM con glucosa alta, fracción V de albúmina bovina (BSA) al 1%, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 20 mM de HEPES. Esterilizar por filtración con una membrana de 0,2 μm del tamaño de un poro y preparar en fresco para cada ensayo.
- Prepare el fijador de celda fría como acetona fría al 80% en PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
- Prepare el tampón de lavado con PBS (0,01 M, PBS, pH 7,2) y 0,3% (v/v) tween-20.
- Prepare el diluyente de anticuerpos con PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 y 5% de leche en polvo descremada.
- Utilice los clones de anticuerpos monoclonales de ratón NP antigripales A como anticuerpo principal. Diluir en el diluyente de anticuerpos a la concentración óptima determinada por la valoración.
- Utilice IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario. Diluir en el diluyente de anticuerpos a la concentración óptima determinada por la valoración.
- Prepare el sustrato de peroxidasa utilizando diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) en tampón de citrato de fosfato 0,05 M a pH 5. Prepare tampón de citrato de fosfato 0,05 M disolviendo 1 cápsula/100 mL de H2O. Disuelva 1 comprimido de OPD (10 mg)/20 mL de tampón de citrato de fosfato inmediatamente antes de usar.
- Utilice 0,5 M de ácido sulfúrico como solución de parada de OPD. Agregue 28 mL de caldo de ácido sulfúrico 18 M a 972 mL deH2Odesionizado en una campana química.
- Tratamiento de sueros humanos y animales
- Inactivar con calor los sueros humanos utilizados en los ensayos MN en un baño de agua a 56 °C durante 30 min antes del ensayo. Utilizar inmediatamente o, en caso necesario, almacenar los sueros descongelados a 4 °C durante no más de 24 h; si se necesita un período de almacenamiento más largo, almacene los sueros congelados a -20 °C o más fríos.
- Tratar los sueros animales utilizados en los ensayos MN con la enzima destructora del receptor (RDE) e inactivar el calor antes del ensayo de la siguiente manera.
- Descongele los sueros en un baño de agua a 37 °C y colóquelos sobre hielo. Mezclar 1 volumen de muestra de suero animal con 3 volúmenes de RDE. Incubar a 37 °C durante 18 - 20 h.
- Inactive con calor los sueros tratados con RDE a 56 °C durante 30 min. Añada 6 volúmenes de PBS, pH 7,2 a cada muestra para una predilución final de 1:10. Si es necesario, almacene los sueros descongelados a 4 °C durante no más de 24 horas; si se necesita un período de almacenamiento más largo, almacene los sueros congelados a -20 °C o más fríos.
nota: Los sueros animales pueden contener varios glicanos de ácido siálico que pueden unirse a las hemaglutininas o HA de los virus de la influenza e inhibir la unión de anticuerpos anti-HA específicos de la influenza. Por lo tanto, es necesario tratar con RDE todos los sueros animales antes de los ensayos de MN para eliminar estos aglutinantes de HA viral inespecíficos en las muestras de suero.
>2. Paso del cultivo celular MDCK-SIAT1
NOTA: Todos los cultivos celulares deben realizarse en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación.
- Decantar el medio de cultivo celular de la monocapa celular enmatraces de 162 cm2. Tripsinizar las células enjuagando la monocapa con ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA). Añadir 5 mL de tripsina-EDTA para cubrir la monocapa celular. Incubar a 37 °C, 5% de dióxido de carbono, CO2 hasta que se desprenda la monocapa (5-10 min). Añada 15 ml de medio de cultivo celular MDCK-SIAT1 a cada matraz que contenga células tripsinizadas y pipetee hacia arriba y hacia abajo para separar las células.
- Use un hemocitómetro y azul de tripán para determinar los recuentos celulares y la viabilidad. Siembre las células en nuevos matraces de cultivo de tejidos de 162cm2 que contengan 30 mL de medios de cultivo celular con 2-2,5 x 106 células/matraz e incube a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días para su uso en ensayos TCID y MN. Siembre las células a 4 - 5 x 106 células/matraz e incube a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días para su uso en la propagación >
nota: La densidad de siembra se puede ajustar si se desean períodos de cultivo más cortos o más largos. Para la propagación del virus, las células deben alcanzar más del 100% de confluencia. Para los ensayos de dosis de infección en cultivo de tejidos (TCID) y MN, las células deben tener una confluencia del 75 al 95% (Figura 1).
>3. Propagación de virus A(H3N2) en células MDCK-SIAT1
NOTA: El virus A(H3N2) puede propagarse en huevos de gallina embrionados de 10 a 11 días de edad según el protocolo estándar, o en cultivos celulares MDCK-SIAT1. Las células MDCK-SIAT1 deben alcanzar más del 100% de confluencia para la inoculación del virus. Las existencias de semillas del virus se pueden inocular con múltiples diluciones de inóculo. Las diluciones de inóculo con la mejor cosecha de HA e infectividad se pueden utilizar para ensayos de MN adicionales.
- Retirar el medio de cultivo celular de la monocapa celular (>100% de confluencia) en matraces de 162cm2. Lavar la monocapa dos veces con 15 mL de PBS estéril de 0,01 M, pH 7,2, y decantar.
- Etiquete 1 matraz como control y agregue 20 mL de medio de propagación del virus. Incubar el matraz a 37 °C con 5% de CO2. Deje este matraz intacto y utilícelo para la comparación después del día 1 de propagación del virus.
- Añadir 10 mL de medio de propagación del virus estéril al matraz o matraces e incubar todos los matraces a 37 °C, 5% de CO2. Descongele un vial de caldo del virus de la influenza a temperatura ambiente y luego colóquelo en hielo. Diluir con los medios de propagación del virus hasta las diluciones objetivo.
nota: Las diluciones objetivo se pueden ajustar en función de los títulos de HA de las existencias de virus. Para preparar un inóculo diluido 1:1000, agregue 100 μL de virus a 9,9 mL de medio de propagación estéril del virus. Invierta suavemente, retire 1 mL de dilución 1:100 a 9 mL de medio de propagación del virus estéril e invierta suavemente para obtener un inóculo diluido 1:1000. Colocar sobre hielo.
- Retire de la incubadora todos los matraces excepto el matraz de control. Retire los medios de propagación del virus de los matraces de las células MDCK-SIAT1 e inocule cada matraz con 10 ml de virus diluido. Incubar los matraces a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 h, rotando el matraz cada 15 min.
- Retire 5 mL de inóculo del (los) matraz (s) y reemplácelo con un medio de propagación del virus de 15 mL que contenga 1 μg/mL de tripsina tratada con clorometilcetona de Tosil fenilalanil (TPCK-tripsina). Incubar el matraz o matraces a 37 °C, 5% de CO2 durante 16-18 h.
- Después de la incubación durante la noche, observe el (los) matraz (s) bajo un aumento de microscopio de 100X y busque efectos citopáticos (CPE) en las células. Retire 15-17 mL de sobrenadante de virus del matraz (s) y reemplácelo con 15 - 17 mL de medio de propagación de virus recién preparado que contenga 2 μg/mL de TPCK-tripsina.
- Incubar los matraces a 37 °C, 5% de CO2. Monitorizar el CPE de la monocapa (en comparación con el matraz de control de celdas) y comprobar el AH periódicamente (cada 4 h) con 0,75% gpRBC hasta la cosecha.
- Configure una placa de microtitulación HA de 96 pocillos. Añadir 50 μL de 0,01 M de PBS, pH 7,2 a los pocillos A2 - A12 y B2 - B12 (duplicados), y a los pocillos H1 - H12 para el control.
- Agregue 100 μL de sobrenadante de virus a A1 y A2, y realice una dilución en serie de 2 veces desde A1 y B1 a A12 y B12. Deseche 50 μL después de mezclar A12 y B12. Agregue 50 μL de glóbulos rojos con glóbulos rojos al 0,75 % en las filas A, B y H.
- Golpee la placa e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
- Determine la HA del sobrenadante del virus inclinando la placa de microtitulación de 96 pocillos en un ángulo de 45° a 60°.
- Lea las placas para la hemaglutinación; la dilución más alta del virus que logra la hemaglutinación completa se considera el criterio de valoración de HA para el virus específico. Registre el recíproco de la dilución más alta del virus con hemaglutinación completa como el título de HA del virus.
nota: Los glóbulos rojos asentados en la fila H (controles) deben comenzar a "correr" y formar una pequeña forma de lágrima debido a la gravedad. Espere hasta que los RBC de los pozos de control terminen de funcionar y, a continuación, lea los botones de RBC de los pozos de valoración de virus. Aquellos que exhiben botones de glóbulos rojos y "corren", no logran hemaglutinación. Localice la dilución más alta del virus que inhibe completamente la hemaglutinación como título de HA del punto final del virus.
- Recoja el virus cuando la HA del cultivo del virus se estabilice o el cultivo del virus alcance el HA objetivo (por ejemplo, una unidad de >16 HA), pero antes de que la monocapa celular comience a mostrar un CPE significativo.
- Centrifugar el sobrenadante de cultivo viral a 300 x g durante 10 min a 4 °C para granular los restos celulares. Transfiera el sobrenadante clarificado que contiene la cosecha del virus a un tubo limpio. Alícuota el sobrenadante que contiene el virus se recoge en viales criogénicos estériles de un solo uso y se congela inmediatamente a -70 °C o más frío.
nota: Las existencias de virus utilizadas para los ensayos de MN deben tener un alto título infeccioso y un mínimo de partículas defectuosas. La dilución mínima de las existencias de virus para lograr 100 TCID50/50 μL para el ensayo MN es 1:100.
nota: Las existencias de virus utilizadas en los ensayos de MN no deben descongelarse ni volver a congelarse.
>4. Determinación del TCID del virus
- Día 1: Titulación del virus
- Descongele un vial del virus a temperatura ambiente y colóquelo inmediatamente en hielo.
- Pruebe el virus en dos diluciones iniciales diferentes: 10-2 y 10-3. Agregue 100 μL de virus a 9,9 mL de diluyente de virus para una dilución 10-2. Agregue 1 mL de dilución 10-2 a 9.0 mL de diluyente de virus para una dilución 10-3.
- Usando dos placas de microtitulación (placa 1 para dilución 10-2 y placa 2 para dilución 10-3), agregue 100 μL de diluyente de virus a todos los pocillos excepto a la columna 1 de la placa de microtitulación de 96 pocillos.
- Realizar diluciones de 1/2log10 (10-2, 10-2,5, 10-3, etc.). Agregue 146 μL del virus iniciando la dilución a todos los pocillos en la columna 1 y transfiera 46 μL en serie desde la columna 1 hasta la columna 11 (Figura 2). Cambie las puntas de pipeta entre pocillos. Después de mezclar la columna 11, deseche las puntas con la dilución de 46 μL.
- Utilice la columna 12 como control de celda (CC); solo contiene diluyente de virus. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% de CO2.
- Día 1: Preparación de las células MDCK-SIAT1
nota: La monocapa celular MDCK-SIAT1 debe alcanzar una confluencia del 75 al 95% para los ensayos TCID y MN. Un matraz de162 cm2 con una confluencia del 95% debería producir suficientes células para sembrar ~ 4 - 5 placas de microtitulación.
- Lave la monocapa confluente al 75 - 95% con 20 mL de PBS para eliminar el FBS en el medio de cultivo. Tripsinice las células de la siguiente manera.
- Enjuague la monocapa con PBS estéril y agregue 7 mL de tripsina-EDTA para cubrir la monocapa celular. Colocar el matraz plano e incubar a 37 °C, 5% de CO2 hasta que se desprenda la monocapa (aproximadamente 5 - 10 min). Añadir 7 mL de diluyente de virus a cada matraz que contenga las células tripsinizadas.
- Lave las células con diluyente de virus para eliminar el FBS.
- Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml; Llene el tubo con diluyente de virus.
- Decantar a 485 x g durante 5 min. Decantar el diluyente de virus, sustituirlo por 50 mL de diluyente de virus fresco y centrifugar a 485 x g durante 5 min. Decantar el diluyente de virus y sustituirlo por diluyente de virus fresco (10 mL/matraz) para resuspender el pellet.
- Use un hemocitómetro y azul de tripano para determinar el recuento de células y la viabilidad. Ajuste la concentración de células con el diluyente del virus a 1,5 x 105 células/mL.
- Añada 100 μL de células MDCK-SIAT1 diluidas a cada pocillo de las placas de microtitulación (1,5 x 104 células/pocillo) y cubra las placas. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 18 - 20 h.
- Día 2: ELISA
- Fijación de células
- Retire el medio de las placas de microtitulación. Lave cada pocillo con 200 μL de PBS. Agregue 300 μL de acetona fría al 80% a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 10 min. Retire el fijador y deje que las placas se sequen al aire.
- ELISA
- Adición primaria de anticuerpos
nota: El anticuerpo monoclonal antigripal A NP debe utilizarse en exceso como anticuerpo primario en ELISA. Determine la dilución óptima de anticuerpos para cada lote de anticuerpos primarios mediante la realización de titulaciones de anticuerpos en MN. Seleccione la concentración de anticuerpos primarios que esté en exceso y con la mejor relación señal-fondo.
- Diluir el anticuerpo monoclonal antigripal A NP (anticuerpo primario) hasta la concentración objetivo en el diluyente de anticuerpos (por ejemplo, añadir 30 μL de anticuerpo primario a 30 ml de diluyente de anticuerpos para una dilución objetivo de 1:1000).
- Lave las placas 3 veces con 300 μL de tampón de lavado. Añadir 100 μL de anticuerpo primario diluido a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Adición secundaria de anticuerpos
NOTA: La inmunoglobulina anti-ratón de cabra, IgG conjugada con la peroxidasa de rábano picante (HRP) debe usarse en exceso como anticuerpo secundario en ELISA. Determine la dilución óptima de anticuerpos para cada lote de anticuerpos secundarios mediante la realización de titulaciones de anticuerpos. Seleccione la concentración de anticuerpos secundarios en exceso y con la mejor relación señal-fondo.
- Diluir la IgG anti-ratón de cabra conjugada con el anticuerpo HRP (anticuerpo secundario) hasta la concentración objetivo en el diluyente de anticuerpos (por ejemplo, añadir 7,5 μL de anticuerpo secundario a 30 mL de diluyente de anticuerpo para una dilución objetivo 1:4000).
- Lave las placas 3 veces con tampón de lavado de 300 μL. Añadir 100 μL de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Adición de sustrato y lectura de placas
- Lave las placas 5 veces con tampón de lavado de 300 μL y toque una toallita sin pelusa.
- Agregue 100 μL de sustrato recién preparado a cada pocillo e incube a temperatura ambiente hasta que el desarrollo del color se sature y la densidad óptica (DO) de los pocillos de control celular <0.2.
- Agregue 100 μL de solución de parada a todos los pocillos. Lea el diámetro exterior de los pozos a 490 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.
- Cálculo del TCID 50
- Calcule la mediana OD490 de los controles de celda (columna 12).
- Considere cualquier pocillo de prueba con un DE490 mayor que el doble de la mediana de DO490 de los pocillos CC como "positivo"; de lo contrario, se considera "negativo".
- Calcule el TCID50 del virus utilizando el método de Reed-Muench.
- Determine el número de positivos y negativos en cada dilución.
- Calcule el "positivo acumulado", el "negativo acumulado", el "cociment" y el "% positivo" como se ilustra en la Tabla 1.
- Calcule la "distancia proporcional" entre la dilución que muestra >50% de positivos y la dilución que muestra <50% de positivos utilizando lo siguiente:
nota: El factor de corrección para la dilución de 1/2 log es de 0,5. Por ejemplo, en la Tabla 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
- Calcule el virus TCID50 sumando la distancia proporcional a la dilución que muestre > 50% de positivismo.
nota: Por ejemplo, en la Tabla 2, TCID50 es 10-5+(-0,25) = 10-5,25. NOTA: este es el TCID50 del virus por 100 μL (o 10-5,25/100 μL).
- Calcule la dilución del virus. Para los ensayos de MN, diluya el virus a 200 TCID50/100 μL (equivalente a 100 TCID50/50 μL por pocillo).
nota: En el ejemplo de la Tabla 1, 1 TCID50 es 10-5,25 en 100 μL, y la dilución para lograr 200 TCID50/100 μL es 1:891 según los cálculos: 200 x 10-5,25 = 10-2,95 = 1/102,95 = 1/891
5. Ensayo MN con células MDCK-SIAT1
- Día 1: Prueba y control de la preparación de sueros y disposición de las placas
- Descongele los sueros en un baño de agua a 37 °C y retírelos inmediatamente después de descongelarlos. Alícuota la cantidad de sueros que debe analizarse; se necesita un mínimo de 10 μL de suero original para realizar pruebas con un virus en una camiseta singlete. Pruebe los sueros por duplicado si es posible.
- Inactivar con calor los sueros humanos durante 30 min en un baño de agua a 56 °C como en el paso 1.12.1. Coloque sueros en hielo después de la inactivación por calor y agregue el diluyente del virus a sueros para lograr una predilución de 1:10.
- Tratamiento RDE y prediluir sueros animales a 1:10 para utilizarlos en controles según 1.12.2.
nota: Los sueros humanos y animales descongelados y tratados pueden almacenarse a 4 °C durante no más de 24 horas. Los sueros deben almacenarse congelados a -20 °C o más fríos si se necesita un período de almacenamiento más largo antes del ensayo.
- Para realizar la prueba con un virus, añadir 100 μl de sueros diluidos 1:10 en las columnas A1 a A10 (figura 3). Agregue 50 μL de diluyente de virus a las filas B a H, excepto las columnas 11 y 12 (Figura 3). Realice una dilución en serie de 2 veces desde las filas A a la H y deseche los últimos 50 μL en la fila H (Figura 3).
nota: Cuando se van a analizar varios virus, los sueros se pueden diluir en tubos de título. La dilución del suero, para determinar el título sérico, en el pocillo A es 1:10, el pocillo B 1:20, el pocillo C 1:40, el pocillo D 1:80, el pocillo E 1:160, el pocillo F 1:320, el pocillo G 1:640, el pocillo H 1:1.280 (Figura 3).
- Para el control del virus, agregue 50 μL de diluyente del virus a los pocillos A12, B12, C12 y D12 (sin sueros). Para el control celular, agregue 100 μL de diluyente de virus a los pocillos E12, F12, G12 y H12 (sin virus, sin sueros).
- Para los sueros de control (por ejemplo, sueros de hurón), añada 100 μL de suero de control diluido al pocillo A columna 11 y añada 50 μL de diluyente de virus a los pocillos B11 - H11. Diluido en serie.
- Cubra las placas e incube a 37 °C, 5% de CO2 hasta que esté listo para la adición del virus.
- Día 1: Adición de virus
- Diluir el virus a 100 TCID50/50 μL con diluyente de virus.
- Agregue 50 μL de virus diluido a todos los pocillos, excepto a la columna 11 en las placas de titulación inversa (BT) y a los pocillos de control de celdas E12, F12, G12 y H12 en todas las placas (Figura 3). En el caso de las placas con sueros de control en la columna 11, añádase el virus a la columna 11.
- Valoración inversa (BT)
- Incluya un BT en la columna 11 de un conjunto de placas duplicadas (por ejemplo, las placas 1A y 1B). Añada 50 μl de diluyente de virus a todos los pocillos de la columna 11. Agregue 50 μL del virus a 100 TCID50/50 μL al primer pocillo (A11). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Mezcle y transfiera 50 μL a pocillos sucesivos para realizar diluciones en serie de 2 veces. Cambie las puntas de pipeta entre pocillos para evitar la transmisión del virus. Deseche 50 μL del pocillo H11.
- Agregue 50 μL de diluyente de virus a la columna 11 para llevar el volumen final a 100 μL. Golpee las placas para mezclar.
- Incubar las placas a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 h.
- Realizar la adición de células MDCK-SIAT1 el día 1 y ELISA el día 2 como se describe en los pasos 4.2 y 4.3 (también se describe en 5.3 y 5.4)
- Día 1: Adición de células MDCK-SIAT1
- Prepare las células MDCK-SIAT1 como se describe en el paso 4.2. Agregue 100 μL de celdas MDCK-SIAT1 a 1,5 x 105 celdas/mL a cada pocillo (1,5 x 104 celdas/pocillo). Incubar las placas a 37 °C, 5% CO2 durante 18 - 20 h.
- Día 2: ELISA
- Después de la incubación durante la noche, en el segundo día, fije las células con un 80% de acetona fría como se describe en el paso 4.3.
- Adición primaria de anticuerpos
- Lave las placas 3 veces con tampón de lavado de 300 μL. Diluir el anticuerpo monoclonal antigripal A NP (anticuerpo primario) hasta la concentración óptima determinada por la titulación en el diluyente de anticuerpos (por ejemplo, añadir 30 μL de anticuerpo primario a 30 ml de diluyente de anticuerpo para una dilución objetivo de 1:1000).
NOTA: Se requieren 100 μL de anticuerpo primario por pocillo. Se necesitan ~ 10 ml por placa.
- Añadir 100 μL de anticuerpo primario diluido a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Adición secundaria de anticuerpos
- Lave las placas 3 veces con tampón de lavado de 300 μL. Diluir la IgG anti-ratón de cabra conjugada con el anticuerpo HRP (anticuerpo secundario) hasta la concentración objetivo en el diluyente de anticuerpos (por ejemplo, añadir 7,5 μL de anticuerpo secundario a 30 mL de diluyente de anticuerpos para un objetivo 1:4000).
NOTA: Se requieren 100 μL de anticuerpo secundario por cada 96 pocillos. Se necesitan ~ 10 ml por placa.
- Añadir 100 μL de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Adición de sustrato y lectura de placas
- Lave las placas 5 veces con tampón de lavado de 300 μL y toque la toallita sin pelusa.
- Añadir 100 μL de sustrato recién preparado a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente hasta que los pocillos de control del virus alcancen un OD490 = 0,8 - 3, con el control de la célula en un fondo bajo OD490 <0,2.
- Agregue 100 μL de la solución de parada a todos los pocillos. Lea el diámetro exterior de los pozos a 490 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.
- Análisis de datos
nota: Los cálculos de MN se determinan para cada placa individualmente.
- Determine el título de anticuerpos neutralizantes de cada muestra de suero.
- Calcule el punto de corte OD490 del 50% de neutralización del virus para cada placa utilizando la siguiente ecuación:
nota: Aquí x = 50% del punto de corte de neutralización. La dilución sérica recíproca correspondiente a la dilución más alta con DO490 inferior al 50% del punto de corte (≥50% de inhibición) se considera el título de anticuerpos neutralizantes para esa muestra de suero (Figura 4).
- Compruebe que los pocillos de control de células tengan un OD490 <0,2 y que los pocillos de control de virus tengan un OD490 = 0,8 - 3.
- Verifique la infectividad del virus en cada ensayo (100x TCID50) por el virus BT. El rango aceptable de BT es 50, 100 o 200 TCID. Si se utiliza el mismo punto de corte definido en el paso 4.4.2, la dilución de virus más alta en la columna BT con DO por encima del punto de corte debe estar en los pocillos E11, F11 y G11.
nota: Los controles positivos séricos deben proporcionar títulos dentro de 2 veces los valores obtenidos en las pruebas anteriores. La DO490 del control sérico negativo debe ser similar a la observada para el control del virus.
