Un ensayo para detectar el estallido oxidativo en los discos foliares de Arabidopsis tras la inmunitaria

Resumen

Fuente: Bredow, M., et al. Ensayos de Estallido Oxidativo y Inhibición del Crecimiento de las Plántulas Activados por Patrones en Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un ensayo para medir el estallido oxidativo en las hojas de Arabidopsis tras la elicitación inmune. Los discos de las hojas, cortados de las hojas de las plantas, se incuban con péptidos bacterianos que funcionan como patrones moleculares asociados a microbios o MAMP. Tras la detección de los MAMP, las células vegetales inducen la producción de ROS extracelulares, que se detectan mediante un ensayo de quimioluminiscencia.

Protocolo

1. Detección de estallido de ROS en discos foliares de Arabidopsis después de la elicitación inmune

1. Crecimiento y mantenimiento de las plantas.
   1. Para sincronizar la germinación, estratifique las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 mL de agar estéril al 0,1% [p/v] y almacene a 4 °C (sin luz) durante 3-4 días.
      nota: Estratificar un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunitarias altas y bajas (por ejemplo, cpk28-1 y bak1-5, respectivamente) para que actúen como controles internos.
   2. Siembre las semillas en el suelo y germine en condiciones estándar de días cortos (22 °C, 10 h de luz, 150 μE/m²/s de intensidad lumínica y 65-70% de humedad relativa).
   3. Después de aproximadamente 7 días, use fórceps para trasplantar plántulas individuales a nuevas macetas, separadas por al menos 4 cm para permitir el desarrollo completo de la roseta. Trasplante de 6 a 12 plántulas por genotipo y regrese a las condiciones estándar de día corto. Riegue y fertilice regularmente las plantas (1 g / L de fertilizante 20-20-20 cada 2 semanas).
2. Recoja los discos de hojas en placas de 96 pocillos para la recuperación durante la noche.
   1. A las 4-5 semanas después de la germinación (Figura 1A), utilice un punzón de biopsia afilado de 4 mm para extraer un disco de hoja por planta, evitando la vena media y teniendo cuidado de limitar las heridas (Figura 1B). Coloque los discos de hojas en una placa luminométrica de 96 pocillos sin usar que contenga 100 μL de agua destilada doble (ddH₂O) con el lado adaxial hacia arriba para evitar la desecación (Figura 1C). Si evalúa varios elicitores, retire 1 disco de hoja de la misma hoja para cada tratamiento con elicitores.
      nota: Muestra hojas que están completamente expandidas, del tercio al quinto desde la parte superior de la roseta, y aproximadamente del mismo tamaño y edad para limitar la variabilidad. Si es posible, corte los discos de las hojas por la mitad con una cuchilla de afeitar antes de la recuperación durante la noche, ya que esto aumenta el área de superficie expuesta a la solución del elicitador.
   2. Recupere durante la noche a temperatura ambiente para evitar la interferencia de ROS producidas por heridas durante la recolección del disco foliar. Cubra las placas con una tapa para evitar la evaporación.
3. Realizar el tratamiento elicitor y medir la producción de ROS.
   1. Programe el lector de placas antes de agregar la solución de reacción, ya que esto reducirá el tiempo entre el inicio de la ráfaga de ROS y las primeras mediciones registradas. Utilice un software comercial que sea apropiado para el lector de placas. En nuestro caso (consulte la tabla de contenido), haga clic en Configuración y seleccione el cartucho LUM96 y el tipo de lectura cinética. Haga clic en la categoría Área de lectura y arrastre para seleccionar un subconjunto de pozos o la placa completa que se va a leer. En la pestaña PMT y óptica, establezca el tiempo de integración en 1.000 ms. En la pestaña Temporización, establezca el Tiempo total de ejecución en 40-60 min y el Intervalo en 2 min.
   2. Extraiga el agua de cada pozo con una pipeta multicanal.
      nota: No perfore los discos de las hojas, ya que esto puede causar estrés por heridas y dar lugar a salidas de ROS más variables.
   3. Prepare una solución de reacción que contenga 100 μM de luminol, 10 μg/mL de peroxidasa de rábano picante (HRP) y la concentración deseada de elicitor (por ejemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) en ddH₂O estéril utilizando 10 mL de solución para una placa de 96 pocillos.
      nota: Disuelva los péptidos liofilizados en H₂O estéril en tubos de baja unión para hacer un caldo de 10 mM, congele rápidamente en N₂ líquido y almacene a -80 °C. Cuando esté listo para usar, diluya las existencias en H₂O estériles para generar un material de trabajo de 100 μM y almacene a -20 °C.
   4. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 100 μL de la mezcla de reacción a cada pocillo, añadiendo la solución a todos los discos de hojas del mismo tratamiento al mismo tiempo. Incluir una reacción de control (sin elicitor) para cada genotipo para evaluar los niveles basales de ROS en ausencia de elicitación. Mida inmediatamente la emisión de luz para todas las longitudes de onda en el espectro visible utilizando un lector de microplacas.
      nota: Prepare y aplique la solución de reacción con poca luz, ya que el luminol y el HRP son reactivos sensibles a la luz. Mantenga los reactivos en hielo o a -20 °C a menos que estén en uso.
   5. Mida la emisión de luz con un tiempo de integración de 1.000 ms en intervalos de 2 minutos durante un período de 40-60 minutos en un lector de microplacas para capturar la ráfaga oxidativa dinámica (Figura 1D)
      nota: Utilice un tiempo de integración más largo para mejorar la sensibilidad del ensayo, al tiempo que garantiza que todas las muestras de una placa de 96 pocillos se puedan medir en un intervalo.

Resultados

Figura 1. Ensayo de estallido oxidativo basado en luminol tras la inducción inmunitaria en Arabidopsis. (A) Cultive plantas en el suelo en condiciones de día corto durante 4-5 semanas. (B) Use un punzón de biopsia de 4 mm para recolectar discos de hojas de cada planta y recuperarlos durante la noche en ddH2O. (C) Agregue solución de reacción (100 μM de luminol, 10 μg / mL HRP y la concentrac...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
20-20-20 Fertilizante	Picana vegetal	10529	Mezclar 1g/L en agua y aplicar sobre las plantas cada 2 semanas para un crecimiento óptimo.
Punzón de biopsia de 4 mm	Mercado Médico	232-33-34-P	También se puede utilizar un juego de barrenadores de corcho con una superficie de 0,125 cm^2.
BioHit mLine Pipeta Mecánica 12 Multicanal (30-300 uL)	sartorio	725240	Se puede utilizar cualquier pipeta multicanal, así como una sola pipeta si es necesario.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Almacene 10 mM de péptido madre a -80 °C en tubos de unión a proteínas bajas. Cuando se descongele, almacene 100 uM de material de trabajo a -20 °C.
fórceps	Fisher Científico	22-327379
Peroxidasa de rábano picante	Sigma-Aldrich	P6782	Disolver en agua pura. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	Disolver en DMSO. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
Sales basales de Murisage y Skoog	Laboratorios Cedarlane	MSP09-100LT	Almacenar a 4C.
suelo	SunGrow Horticultura	Mezcla de sol #1	También se pueden utilizar otros tipos de suelo para cultivar Arabidopsis. Mezclar con agua al llenar las ollas.
Lector de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm con módulo LUM	Dispositivos moleculares		Cualquier lector de placas capaz de detectar luminiscencia se puede utilizar para estos ensayos.
Placas de poliestireno blanco de 96 pocillos	Fisher Científico	07-200-589