Medición de la inhibición inducida por el sistema inmunitario del crecimiento de las plántulas

Resumen

Fuente: Bredow, M. et al., Ensayos de Estallido Oxidativo Activado por Patrones e Inhibición del Crecimiento de las Plántulas en Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Este video muestra el ensayo de inhibición del crecimiento de plántulas en la planta Arabidopsis thaliana. Se determina el impacto del aumento de la concentración de elicitor de péptidos inmunes en el crecimiento de las plántulas.

Protocolo

1. Ensayo de inhibición del crecimiento de plántulas

1. Esterilice las semillas y siembre en placas Murashige y Skoog (MS).
   1. Prepare un medio MS estéril de media concentración (0,5x) (2,16 g/L) que contenga un 0,8% de agar [p/v]. Vierta el medio en placas (90 x 15 mm) en una campana de flujo laminar.
   2. Esterilizar aproximadamente 100 semillas en un tubo de microcentrífuga lavando con 1 mL de etanol al 70% durante 2 min y retirar por aspiración. Agregue 1 ml de lejía al 40% y meca suavemente durante 17 minutos a temperatura ambiente. Retirar la lejía por aspiración y lavar tres veces en 1 mL de agua estéril durante 5 min. Resuspender en 1 mL de agar estéril al 0,1%.
      nota: Alternativamente, utilice un protocolo de esterilización de semillas con gas cloro24.
   3. Siembre aproximadamente 100 semillas por genotipo en placas de agar MS utilizando una pipeta y selle con cinta de microporos en una campana de flujo laminar.
      nota: Evite colocar las semillas muy cerca, ya que esto dificultará el trasplante de plántulas más adelante.
   4. Estratificar las semillas colocando placas a 4 °C (sin luz) durante 3-4 días para sincronizar la germinación (Figura 1A).
2. Trasplante las plántulas en placas de 48 pocillos que contengan péptidos elicitores inmunes.
   1. Después de la estratificación, mueva las placas a la luz en condiciones de día corto (22 °C, 10 h de luz, 150 μE/m²/s de intensidad de luz y 65-70% de humedad relativa) durante 3-4 días para permitir la germinación.
   2. En una campana de flujo laminar, prepare diluciones de péptidos elicitores (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1,000 nM) en medios líquidos estériles de MS 0.5x que contengan 1% de sacarosa [p/v], usando 25 mL de MS para cada placa de 48 pocillos. Prepare las placas pipeteando 500 μL de medio líquido MS o medio MS que contenga péptidos por pocillo. Si está disponible, use una pipeta repetida para la preparación de la placa para acelerar el proceso.
      nota: Para cada genotipo, cultive plántulas en MS sin elicitor para tener en cuenta las diferencias inherentes en el crecimiento de las plántulas.
   3. Con pinzas estériles, trasplante cuidadosamente una plántula a cada pocillo del mismo tamaño y edad, asegurándose de que no haya daños en la plántula o rotura de la raíz y que la raíz esté sumergida en el medio. Para cada genotipo, trasplante un mínimo de 6-8 plántulas en cada dilución de péptido (Figura 1B).
      nota: Trasplante las plántulas a los 4 días después de la germinación, ya que las raíces cortas son más fáciles de manipular y las plántulas más viejas pueden producir resultados menos óptimos.
   4. Selle las placas con cinta de microporos y vuelva a la luz en condiciones estándar de días cortos (22 °C, 10 h de luz, 150 μE/m²/s de intensidad de luz y 65-70% de humedad relativa). Deje que las plántulas crezcan durante 8-12 días.

>2. Determine el porcentaje de inhibición del crecimiento.

1. Retire con cuidado las plántulas de los platos de 48 pocillos y séquelas frotándolas con una toalla de papel. Pese las plántulas en una báscula analítica y registre los valores. Si está disponible, utilice una báscula analítica equipada con salida USB para registrar los valores de peso fresco en una hoja de cálculo. Antes de pesar las plántulas, tome una foto para mostrar visualmente la inhibición del crecimiento (Figura 1C).
2. Determine el porcentaje de inhibición del crecimiento de las plántulas tratadas con elicitor en comparación con las plántulas cultivadas en MS solo de la siguiente manera:
   
3. Represente los datos utilizando un gráfico de barras con barras de error estándar o utilizando un gráfico de caja y bigotes para mostrar mejor la varianza interexperimental.

Resultados

Figura 1. Ensayo de inhibición del crecimiento de plántulas inducido por elicitor en Arabidopsis. (A) Siembre las plántulas en agar MS y crezca durante 3-4 días en condiciones estándar de días cortos. (B) Trasplante las plántulas a placas de 48 pocillos que contengan medio MS o MS que contengan diferentes concentraciones de elf18. (C) Después de 8-12 días, evalúe visualmente el tamaño de la ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas estériles de 8 pocillos con tapa	Sigma-Aldrich	CLS3548
Escala analítica con borrador Sheid	VWR	VWR-225AC	Se puede utilizar cualquier escala analítica estándar para los ensayos de incidencia de crecimiento, sin embargo, una salida directa por computadora es óptima.
BioHit mLine Pipeta Mecánica 12 Multicanal (30-300 uL	sartorio	725240	Se puede utilizar cualquier pipeta multicanal, así como una sola pipeta si es necesario.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Almacene 10 mM de péptido madre a -80 grados C en tubos de unión a proteínas bajas. Cuando esté descongelado, almacene 100 uM de material de trabajo a -20 grados C.
Sales basales de Murisage y Skoog	Laboratorios Cedarlane	MSP09-100LT	Guárdelo a 4 grados C.
Placas de poliestireno blanco de 96 pocillos	Fisher Científico	07-200-589