NOTA: El protocolo es aplicable a diferentes tejidos vegetales. En este protocolo se utilizaron vaina de arroz y discos foliares para la detección de ROS tras la elicitación de PAMP. Dado que las diferencias surgen principalmente debido al método de muestreo, a continuación solo se describen los procedimientos comunes, con pasos específicos que se mencionan cuando sea necesario.
1. Preparación y pretratamiento de tejidos
- Vaina de arroz
- Corte la vaina de las plántulas de arroz de 10 días de edad en segmentos de 3 mm con una cuchilla de afeitar afilada o una cuchilla quirúrgica para el pretratamiento 1 día antes del ensayo ROS (Figura 1B).
- Coloque cinco segmentos de vaina en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 μL de agua destilada doble (ddH2O) durante 10-12 h, en la oscuridad a 25 °C, lo que permite la fuga de iones relacionada con la lesión de la herida y las respuestas de defensa al abato (Figura 2)
nota: Tener cuidado de mantener los cortes verticales para garantizar un área de superficie de corte constante expuesta a la solución de elicitación es un paso importante para obtener resultados altamente reproducibles. Mueva los segmentos suavemente. No haga cortes o heridas adicionales en los segmentos, lo que podría ser una fuente de variación de datos. Como principio, cada prueba debe contener al menos cinco réplicas, ya que la variación del valor de ROS es grande. Cuantas más réplicas se establezcan, más fiables serán los datos.
- Disco de hoja
- Corte los discos de las hojas (4 mm de diámetro) de las plantas de arroz de 4 a 6 semanas de edad con un punzón de biopsia con un émbolo. Siempre corte los discos de hojas del tercio medio de la segunda hoja (numerados desde la parte superior) del cultivador principal para reducir la variación de datos (Figura 1C).
- Coloque un disco de hoja en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 μL de ddH2O durante 10-12 h para el pretratamiento, lo que permite que las respuestas relacionadas con las heridas disminuyan, ya que podrían interferir con la inducción de ROS por PAMPs (Figura 2).
nota: Opere los discos de las hojas con cuidado. No haga cortes o heridas adicionales en los discos en el experimento, lo que podría resultar en variaciones en los datos. La inducción de ROS se produce principalmente a partir de las células del borde cortado, ya que las superficies de los tejidos del arroz (hojas o vainas) están cubiertas de capas hidrofóbicas. Solo las celdas de los bordes cortados están en contacto con la solución de elicitación (consulte la sección de discusión).
- Mantenga todos los discos foliares flotando, con la superficie abaxial hacia arriba, en los pocillos de una placa de microtitulación para el pretratamiento del agua y evitar la variación asociada al lado de la hoja.
>2. Preparando la solución de elicitación
- Disuelva el polvo de L-012 en una solución acuosa de 20 mM (6,23 mg/mL) con ddH2O para hacer la solución madre. A continuación, diluir la solución madre con 50 mM de tampón Tris HCl (pH 7,5) para hacer la solución de trabajo a la concentración final de 500 μM L-012. Mantenga la solución madre congelada y diluya en la solución de trabajo antes de usarla.
- Prepare la solución de elicitación que contiene PAMP, L-012 y peroxidasa de rábano picante (HRP; 10 mg/mL en ddH2O). Para una solución de elicitación de 10 mL, mezcle 9,4 mL de 50 mM de solución de Tris HCl (pH 7,5), 400 μL de la solución L-012, 100 μL de HRP y 100 μL de flg22 (PAMP; 10 mM en ddH2O). Para el control negativo, agregue 100 μL de ddH2O en lugar de PAMP.
nota: Mantenga las soluciones de elicitación preparadas a temperatura ambiente para evitar el estrés por frío en los tejidos de arroz. También se pueden utilizar otros PAMP para el tratamiento según sea necesario, como la quitina (20 ng/mL en concentración final). Dado que L-012 es sensible a la luz, cubra todos los tubos que contengan la solución de L-012 con papel de aluminio.
>3. Iniciar el software y configurar el protocolo con el lector de microplacas referenciado (ver Tabla de Materiales)
>NOTA: Se necesita algún tiempo para configurar los parámetros del software del lector de microplacas. Se recomienda preparar la máquina y el protocolo (un clic para continuar) antes de agregar la solución de elicitación.
- Inicie el software. Haga clic en el botón Experimentos para crear un nuevo protocolo o utilizar un protocolo existente.
- Haga clic en Procedimiento en la ventana emergente para configurar la placa. Seleccione los pocillos de la placa a monitorear.
- Haga clic en Iniciar cinético para configurar el tiempo total de ejecución y el intervalo de lectura. Establezca el tiempo de ejecución en 35 minutos o más, en función de los requisitos experimentales. Para obtener lecturas con la mayor frecuencia posible, seleccione Intervalo mínimo. Para el tiempo de integración, elija 1 s o más, dependiendo de la intensidad de la señal.
NOTA: El intervalo de lectura depende del número de muestras y de la duración de la integración de la señal.
- Haga clic en Validar | OK para confirmar la configuración.
- Haga clic en Detectar la nueva placa en la ventana emergente y espere a que el software le muestre el cuadro de diálogo de carga de la placa. Coloque la placa que se va a probar en el soporte.
- Deténgase aquí para esperar a que se establezca el sistema de elicitación (en la siguiente sección). Tan pronto como el sistema de elicitación esté listo, haga clic en Ejecutar para iniciar la lectura.
>4. Establecer el sistema de elicitación y medir la producción de ROS en tiempo real
- Retire con cuidado el ddH2O de los pocillos que contienen los tejidos pretratados, evitando cualquier daño o desecación del tejido.
- Utilice una pipeta multicanal para añadir 200 μL de la solución de elicitación a los pocillos que contienen los tejidos.
- Agite suavemente para mezclar. Haga clic en Ejecutar para iniciar la detección.
nota: Con el tratamiento PAMP, los tejidos vegetales responden y producen ROS muy rápidamente. Por lo tanto, se sugiere que el control negativo sin PAMP sea tratado primero para reducir el tiempo de operación cuando hay múltiples tratamientos. Opere lo más rápido posible para reducir el retraso en la obtención entre tratamientos. Cuanto más corto sea el tiempo entre la adición de la solución de elicitación y el inicio de la detección, mejor será la captura de datos experimentales importantes.
