>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica
- Obtener sangre humana entera de un donante sano o de un paciente a través de venopunción utilizando vacutainers que contienen anticoagulante ácido-citrato-dextrosa (ACD) (tubos amarillos).
nota: La sangre entera puede almacenarse en ACD a temperatura ambiente (18-22 °C) durante un máximo de 36 horas antes de continuar con el siguiente paso. Normalmente, 1-2 tubos vacutainer de 10 mL de sangre entera son suficientes para el ensayo.
- Diluir la sangre entera 1:1 v/v en medio RPMI completo tibio (RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 20 mM de HEPES y 0,01 mg/mL de gentamicina).
- Aísle las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre entera diluida mediante centrifugación en gradiente de densidad, según lo recomendado por el fabricante (consulte la lista de materiales). Coloque la sangre diluida muy lentamente sobre el gradiente de densidad (calentada a temperatura ambiente, 18-22 °C).
nota: Minimice la cantidad de mezcla en la interfaz para la separación óptima de la sangre colocando cuidadosamente la mezcla de sangre en capas gota a gota o utilizando una pipeta.
- Permita que la mezcla de sangre se acumule lentamente sobre la parte superior del gradiente de densidad colocando la punta de la pipeta cerca del gradiente de densidad y permitiendo que la mezcla de sangre corra por el costado del tubo muy lentamente.
- Dependiendo de la escala del experimento, coloque 10 mL de mezcla de sangre sobre 3 mL de gradiente de densidad (en un tubo de 15 mL) o 35 mL de mezcla de sangre sobre 15 mL de gradiente de densidad (en un tubo de 50 mL). Por lo general, 10 mL de sangre completa producen 10 millones de PBMC, con alguna variación de donante a donante.
nota: Es muy importante que no haya mezcla de la mezcla sanguínea con el gradiente de densidad. La mezcla de sangre debe superponerse sobre el gradiente de densidad y aumentar lentamente hasta que toda la sangre esté encima del gradiente de densidad.
- Centrifugar la mezcla en capas a 700 x g durante 30 min sin frenos. La mezcla centrifugada debe separarse en 5 capas (de arriba a abajo): plasma, capa leucocitaria (que contiene PBMC), material de gradiente de densidad, granulocitos y glóbulos rojos.
- Retire y deseche la mayor parte del plasma y recupere cuidadosamente el contenido de la capa leucitaria (PBMC) en un nuevo tubo de 15 ml utilizando una pipeta Pasteur y una pera de succión.
nota: La eliminación de la capa de capa leucocitaria se realiza de forma eficaz aplicando succión sobre la pipeta Pasteur mientras se realiza un movimiento circular alrededor del exterior de la capa, con la punta de la pipeta contra el tubo.
- Lave las PBMC aisladas tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,3 centrifugando a 350 x g durante 10 min (con frenos completos) entre lavados. Reconstituya el pellet PBMC en medio RPMI completo. Dependiendo del tamaño del pellet, 3-7 mL de medio es suficiente.
- Cuente el PBMC usando azul de tripán y un hemocitómetro. Solo cuenta aquellas células que no están manchadas por el azul de tripán. Reconstituya las PBMC a 1.750.000 células/mL en un medio RPMI completo.
- Siembre 400 μL (700.000 células) en cada pocillo de un portaobjetos de 8 cámaras. Incubar el portaobjetos en una incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificada a 37 °C (suplementada con 5% de CO2) durante 1 h para permitir que los monocitos/macrófagos se adhieran.
>2. Pretratamiento de los monocitos adheridos
NOTA: Este paso solo es necesario si se buscan formas de inhibir o mejorar la fagocitosis.
- Trate previamente los monocitos adheridos con cualquier fármaco o compuesto de interés. Reconstituya el (los) fármaco (s) u otro material de prueba a la concentración deseada utilizando un medio RPMI completo.
nota: Por ejemplo, se suelen utilizar 200 μg/mL de IgIV para producir una inhibición de la fagocitosis del 95-100% cuando se utilizan monocitos humanos.
- Aspire y deseche el sobrenadante que contenga células no adherentes del portaobjetos de 8 cámaras después de la incubación de 1 h (después del paso 1.6). Sustitúyalo por 400 μL de un fármaco u otro tratamiento e incube durante 1 h a 37 °C.
- Al aspirar y reemplazar soluciones en el portaobjetos de 8 cámaras, asegúrese de controlar el flujo de los fluidos para que las células débilmente adheridas no se levanten. Además, trabaje con solo 2-3 pozos vacíos a la vez y evite secar los pozos.
nota: Por lo general, cada tratamiento se realiza por triplicado técnico.
>3. Opsonización de glóbulos rojos R2R2
NOTA: Los glóbulos rojos R2R2 opsonizados se utilizan como control positivo para la fagocitosis mediada por FcγR. Naïve R2R2 debe almacenarse en la solución de Alsever (para prolongar la vida útil) a 4 °C durante un máximo de 1 mes. La solución de Alsever se fabrica internamente y se compone de 0,8 % p/v de citrato trisódico (dihidratado), 1,9 % p/v de dextrosa, 0,42 % p/v de cloruro de sodio y 0,05 % p/v de ácido cítrico (monohidrato). Si las células R2R2 no están disponibles, se pueden utilizar otras células con fenotipo Rh, como R1R 2, R1 R1, R1ro R2r.
- Lave los glóbulos rojos R2R2 (cDE/cDE) en PBS un total de tres veces utilizando la centrifugación a 350 x g durante 5 min cada una.
nota: La cantidad de glóbulos rojos necesarios depende del tamaño experimental y se puede calcular hacia atrás. Lave siempre una cantidad excesiva de glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se pierden durante cada lavado debido a la lisis o durante la eliminación del sobrenadante. Por ejemplo, en un experimento con 5 tratamientos y 2 controles, todos realizados por triplicados técnicos, hay un total de 21 pozos. 21 pocillos con 400 μL/pocillo de mezcla de glóbulos rojos al 1,25% indican que se necesitan 105 μL de glóbulos rojos opsonizados empaquetados. 200 μL de glóbulos rojos deben lavarse inicialmente y 150 μL deben ser opsonizados para asegurar que haya una cantidad adecuada de glóbulos rojos para la etapa de fagocitosis.
- Opsonizar el pellet R2R2 lavado con anticuerpos policlonales anti-D 1:1 v/v de suero humano e incubar durante 1 h a 37 °C, con mezcla intermitente.
nota: Si no se dispone de anticuerpos anti-D policlonales, es posible utilizar anticuerpos anti-D monoclonales, que están disponibles en el mercado, o anti-D, que se utilizan normalmente para la profilaxis inmunitaria Rh, que pueden obtenerse en bancos de sangre o servicios de transfusión. Las pruebas de optimización deben realizarse al principio de la configuración del ensayo y siempre que se cambien lotes de anticuerpos policlonales no titulados o se cambie a un anticuerpo monoclonal. Esto es para identificar la concentración o el volumen óptimo de anti-D requerido para un resultado de la prueba de antiglobulina (IAT) de entre 3+ y 4+ y un resultado de fagocitosis de entre 70 y 90 glóbulos rojos fagocitados por cada 100 monocitos contados.
- Lave el R2R2 opsonizado un total de tres veces en PBS utilizando centrifugación a 350 x g durante 5 min cada uno.
nota: El éxito de la opsonización de R2R2 puede confirmarse realizando un IAT indirecto. En resumen, se añaden anticuerpos policlonales secundarios antihumanos para unirse a los anticuerpos primarios opsonizantes en las superficies de los glóbulos rojos, y la señal amplificada puede observarse en forma de hemaglutinación. Un protocolo detallado del fabricante se puede encontrar en el archivo de materiales complementarios.
- Reconstituya el pellet R2R2 lavado a 1.25% v/v utilizando un medio RPMI completo.
nota: El exceso de R2R2 puede almacenarse en la solución de Alsever a 4 °C durante un máximo de una semana.
>4. Fagocitosis mediada por el receptor Fc
- Aspire el fármaco o el sobrenadante medio del portaobjetos de 8 cámaras y añada 400 μL de la mezcla R2R2 al 1,25 % v/v. Incubar a 37 °C durante 2 h.
- Después de 2 h de incubación, retire las cámaras utilizando los adaptadores del fabricante. Frote el exceso de R2R2 con una toalla de papel. Asegúrese de que el portaobjetos no se seque.
- Llene un vaso de precipitados de 100 ml con PBS. Sumerja y lave el portaobjetos moviéndolo lentamente hacia adelante y hacia atrás (alrededor de 30-40 golpes) para eliminar la mayor parte del R2R2 sin fagocitar.
- Retire la diapositiva del PBS. Limpie el exceso de PBS con una toalla de papel o un pañuelo de papel y seque el portaobjetos al aire.
- Fije el portaobjetos secado al aire en metanol al 100% durante 45 s. A continuación, seque al aire el portaobjetos fijo.
nota: Los portaobjetos se pueden fijar utilizando otro método que sea más compatible con la tinción posterior, como la tinción de Grünwald-Giemsa21 o la tinción de Wright-Giemsa.
- Monte la guía utilizando un medio de montaje Elvanol de fabricación propia (u otro medio de montaje disponible en el mercado) y agregue cubreobjetos.
nota: El medio de montaje Elvanol está compuesto por un 15% p/v de resina de alcohol polivinílico y un 30% v/v de glicerina en PBS. La mezcla se calienta hasta que toda la resina se haya disuelto y la glicerina se mezcle homogéneamente. Esto puede ser reemplazado por otro medio de montaje disponible en el mercado.
- Deje que la montura se seque durante la noche antes de la cuantificación.
>5. Cuantificación de la fagocitosis
- Usando un microscopio de contraste de fase y una lente de objetivo de 40X, cuantifique manualmente la cantidad de eventos fagocíticos contando al menos 200 monocitos y el número de R2R2 fagocitados dentro de estos monocitos. Dispone de un contador en cada mano para cuantificar simultáneamente el número de monocitos y el número de R2R2 fagocitados.
- Obtén el índice fagocítico medio dividiendo el número de R2fagocitados R2 por el número de monocitos y multiplicándolo por 100. Exprese los datos como la media (índice fagocítico medio) ± el error estándar de la media (SEM).
