1. Preparar los reactivos y materiales necesarios
- Prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS) ("tampón de lavado"). Prepare PBS con suero fetal de ternero (FCS) al 2% que contenga detergente no iónico al 0,1% ("tampón de lavado permanente"; consulte la Tabla de materiales). Prepare PBS con 1.5% de formaldehído.
nota: El formaldehído es corrosivo y potencialmente cancerígeno y debe manipularse mientras se usa el equipo de protección personal adecuado.
- Prepare PBS que contenga 2% de FBS y 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para la separación de células magnéticas ("tampón MCS").
- Prepare 50 μg/mL de isotiocianato de faloidina-fluoresceína (Phalloidin-FITC) en dimetilsulfóxido (DMSO). Prepare una tinción nuclear de 1 mg/mL (por ejemplo, 1 mg/mL de 7-amino actinomicina D (7-AAD) en DMSO o colorante bis-bencimida; consulte la Tabla de materiales) en DMSO. Preparar anticuerpos marcados con fluorocromo apropiados para las células de interés y el citómetro de flujo de imágenes.
- Obtener tejidos animales (p. ej., ganglios linfáticos y bazo) como fuente de células T y tejidos animales alogénicos (p. ej., bazo y médula ósea) como fuente de células presentadoras de antígenos o progenitores.
- Prepare el medio de cultivo celular (por ejemplo, el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS), 50 μM de 2-mercaptoetanol, penicilina y estreptomicina y obtenga placas de cultivo celular de 24 y/o 96 pocillos.
>2. Preparar células presentadoras de antígenos (APCs)
NOTA: En teoría, cualquier población de APC podría ser examinada con este método. En este caso, se demandaron células dendríticas (CD) derivadas de la médula ósea de ratón inmaduras como APC. Existen muchos protocolos para generar estas células. Brevemente, se utilizó el siguiente protocolo.
- Enjuague la médula de los fémures y las tibias en RPMI 1640 o DMEM.
- Pase las células suspendidas a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar pequeños trozos de hueso y residuos.
- Granular las células por centrifugación y luego lisar los glóbulos rojos con un tampón de cloruro de amonio durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Granular las células por centrifugación (400 x g, 5 min) y resuspender el pellet celular.
- Lave las celdas en 5 - 10 mL de tampón de lavado, pellet por centrifugación (400 x g, 5 min) y vuelva a suspender el pellet de la celda.
- Enriquezca los precursores hematopoyéticos sobre una columna de separación celular marcando las células con anticuerpos biotinilados anti-CD3 (5 μg/mL), anti-B220 (5 μg/mL), anti-MHC clase II (1 μg/mL) y anti-CD11b (5 μg/mL).
- Granular las células por centrifugación (400 x g, 5 min) y volver a suspender el pellet de la célula.
- Incubar las células con microperlas magnéticas anti-biotina (ver la Tabla de Materiales) a 4 °C durante 10 min.
- Lave y pegue las células (400 x g, 5 min) y vuelva a suspenderlas en 1 mL de tampón MCS antes de retirar las células marcadas utilizando una gran columna de separación de células magnéticas de selección positiva (LS) cebada con 3 mL de tampón MCS y colocada en su imán. Lave la columna 3 veces con 3 mL de tampón MCS; El flujo contendrá las celdas deseadas.
- Cultivo de las células que pasan a través de la columna durante 6 días en RPMI 1640 o DMEM suplementado con 2 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos de ratón recombinante (GM-CSF) y 2 ng/mL de factor de crecimiento transformante humano recombinante β1 (TGFβ1). Reemplace la mitad del medio cada 2 días con un medio completo nuevo que contenga 2 ng/mL GM-CSF y TGFβ1.
NOTA: El TGFβ1 humano tiene actividad en las células de ratón. Los datos se han generado utilizando estos DC inmaduros. Otras células (p. ej., células B y CD maduras) pueden ser adecuadas como APC, pero no se han probado en este ensayo.
- Criopreservar los CD en 90% de suero/10% de DMSO y almacenar en nitrógeno líquido; recupéralos el día de su uso. Antes de usarlo, cuente el número de CD viables en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul de tripano. Vuelva a suspender el pellet de célula en el medio de cultivo a la densidad adecuada (ver paso 4.1) antes de usar en la sección 4.
>3. Preparar células T
- Utilice métodos de selección negativa para evitar transmitir inadvertidamente señales activadoras o inhibidoras a las células.
NOTA: En este ejemplo, las células T CD4+ están preparadas para el análisis.
- Para preparar linfocitos T CD4+ a partir del bazo de ratón, triture el bazo a través de un colador de células de 70 μm con el émbolo de una jeringa. Lave el colador de celdas con tampón de lavado.
- Granular las células suspendidas por centrifugación (400 x g, 5 min) y luego lisar los glóbulos rojos volviendo a suspender el pellet en un tampón de cloruro de amonio durante 5 min a temperatura ambiente.
- Granular las células por centrifugación (400 x g, 5 min) y volver a suspender el pellet.
- Lave las celdas en 5 - 10 mL de tampón de lavado y pellet por centrifugación (400 x g, 5 min). Vuelva a suspender el pellet.
- Teñir las células con anticuerpos biotinilados contra CD8, complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC II, 1 μg/mL) y CD19 (5 μg/mL). Incubar durante 10 min a 4 °C.
- Lavar las celdas en 10 mL de tampón de lavado y pellet por centrifugación (400 x g, 5 min). Vuelva a suspender el pellet.
- Incube las células con microesferas magnéticas anti-biotina (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lave las células en 10 mL de tampón de lavado y pellet por centrifugación (400 x g, 5 min); vuelva a suspender el pellet.
- Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón MCS y enriquezca las células T CD4+ sobre una columna de separación de células magnéticas cebada con 3 mL de tampón MCS en un imán. Lave la columna 3 veces con 3 mL de tampón MCS. El flujo de columna contendrá las células T enriquecidas.
- Mediante citometría de flujo estándar, se evalúa la pureza de las células T utilizando una alícuota de las células seleccionadas negativamente. Tiñir las células con un conjugado de fluorocromo-estreptavidina (para identificar cualquier célula marcada con biotina que debería haberse eliminado en la columna) y un anticuerpo o anticuerpos para identificar la población de células T de interés (CD4 en este caso); Una pureza de ≥85% es aceptable.
- Recuento de los linfocitos T en un hemocitómetro por exclusión de azul de tripán (≥90% de viabilidad es aceptable).
NOTA: El tampón MCS contiene EDTA, que debe eliminarse antes del ensayo. Para lograr esto, granule las células por centrifugación (400 x g, 5 min) y lávelas en 1 mL de tampón de lavado. Vuelva a granular las células (400 x g, 5 min) y vuelva a suspenderlas en medio de cultivo a la densidad adecuada (ver paso 4.1).
>4. Co-incubar células T y DCs
- Células T de siembra y CD en una proporción T:1 DC en una placa de cultivo celular de 24 o 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen final de cultivo sea de ≤500 μL para placas de 24 pocillos o de ≤50 μL para placas de 96 pocillos.
NOTA: Los volúmenes más pequeños fomentan las interacciones célula-célula y dejan espacio para tampones de fijación posteriores.
- Ajuste empíricamente los números precisos de las celdas, pero como guía general, use 1 x 106 celdas T y 0,5 x 106 DC por pocillo (placa de 96 pocillos). Estos deben considerarse el número mínimo de células, ya que el uso de menos células dificulta la enumeración de las sinapsis inmunitarias.
- Para aumentar el número de celdas, configure pocillos replicados y agrupe después del paso 5 (fijación).
NOTA: Al configurar pozos replicados, es aconsejable sembrar primero las CD en todos los pocillos y luego sembrar las células T en todos los pocillos; Esto minimiza las discrepancias en el tiempo de incubación entre pocillos.
- Incubar la placa durante 4 h a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2.
>5. Arreglar celdas en placa
- Agregue 3 veces el volumen de cultivo de formaldehído al 1,5% en PBS a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos; es importante fijar las células antes de retirarlas de la placa para minimizar la interrupción de las interacciones célula-célula.
- Transfiera las células de la placa a tubos para su posterior lavado y tinción. En esta etapa, reserve celdas adicionales para los controles de una sola mancha. Aparte de estos controles, todo el cultivo debe teñirse con el cóctel de anticuerpos (ver paso 4.1.1).
>6. Células de tinción
- Teñir las células en 100 μL de tampón de lavado que contiene un cóctel de los anticuerpos conjugados con fluorocromo deseados durante 30 min a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
NOTA: El cóctel incluye anticuerpos específicos de células T y específicos de APC. Los fluorocromos deben elegirse de manera que puedan distinguirse utilizando la configuración del citómetro de flujo de imágenes. En los experimentos que se muestran aquí, se utilizaron CD11b conjugados con fluoróforos azules (5 μg/mL, ver la Tabla de Materiales) y CD90.2 conjugados con APC (5 μg/mL).
- Lavar las células en 1 mL de tampón de lavado y centrifugar durante 5 min a 400 x g. Decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un tampón de lavado permanente que contenga faloidina FITC a 0,05-0,5 μg/mL e incube durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
NOTA: Las concentraciones de faloidina FITC de aproximadamente 0,1 μg/mL funcionan bien para las células de ratón, pero se espera que la concentración adecuada varíe según el proveedor, el tipo de célula y el citómetro de flujo de imágenes.
- Lavar las células en 1 mL de tampón de permanente/lavado y centrifugar durante 5 min a 400 x g. Decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un tampón de permanente/lavado que contenga colorante nuclear a la concentración adecuada (por ejemplo, aproximadamente 25 μg/mL de 7-AAD) e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Lavar las células en 1 mL de tampón de permanente/lavado y centrifugar durante 5 min a 400 x g. Decantar el sobrenadante. Lave las celdas una vez en tampón de lavado, pellet y vuelva a suspender en 50 - 100 μL de tampón de lavado, transfiriendo las celdas a pequeños tubos de microcentrífuga tapados.
- Proceda a la adquisición de datos inmediatamente o almacene las células a 4 °C protegidas de la luz hasta varios días antes de la adquisición en el citómetro de flujo de imágenes.
NOTA: Las celdas se han almacenado con éxito de esta manera durante un máximo de 7 días. Es posible un almacenamiento más prolongado, pero no se ha probado.
>7. Adquirir datos
- Inicialice y configure el citómetro de flujo de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Garantice la estabilidad del núcleo de flujo antes de recopilar cualquier dato.
- Reserve un canal para la adquisición de imágenes de campo claro. Adquiera datos de control de una sola mancha con el canal de campo claro desactivado.
- Haga clic en el botón "Cargar" e inserte un tubo que contenga una muestra completamente teñida (una muestra que haya sido teñida con todos los fluorocromos requeridos) en el soporte.
- En la ventana "espacio de trabajo", seleccione y cree un nuevo diagrama de dispersión con la relación de aspecto sobre el área y los singletes de puerta donde la relación de aspecto sea cercana a 1. Cree un nuevo diagrama de dispersión para cada canal utilizado (intensidad del canal en el eje horizontal).
- Para cada fluorocromo, verifique la población positiva y, si es necesario, ajuste el voltaje del láser en el cuadro "Iluminación".
- Descargue el tubo y cargue el primer tubo de una sola mancha.
- En el cuadro "Configuración de adquisición", escriba el nombre de la muestra y establezca el número de eventos que se deben recopilar; si se trata de una sola mancha (para los controles de compensación), 1.000 - 2.000 eventos son suficientes.
- En el cuadro "Canales", seleccione los canales con los que se ha teñido cada muestra. Para los controles de una sola mancha, todos los canales deben seleccionarse con campo claro y dispersión lateral desactivados. Haga clic en el botón "Grabar" debajo del cuadro "Adquisición"; Cuando el número de eventos alcance el umbral especificado, la adquisición se detendrá automáticamente.
- Haga clic en el botón "Devolver" para descargar el tubo. Repita los pasos 7.2.4 a 7.2.6 para cada control de una sola mancha. Dependiendo del citómetro y del software, es posible que no sea posible configurar todas las puertas que se muestran en la Figura 1 durante la adquisición (se realiza una compuerta más precisa durante el análisis; consulte la sección 8).
- Adquiera muestras como para muestras de una sola tinción (en el paso 7.2), pero en el cuadro "Canales", seleccione todos los canales necesarios, incluido el canal de campo claro.
- Antes de registrar los datos, compruebe que la intensidad del canal es la adecuada para identificar las poblaciones de células deseadas. De lo contrario, ajuste la configuración del láser y vuelva a grabar los controles de una sola mancha con la nueva configuración, como se describe en el paso 7.2.
- Para cada muestra, adquiera varias decenas de miles de eventos.
nota: En la mayoría de las condiciones, los eventos de contacto entre células son una pequeña minoría del número total de células (la mayoría son células individuales). En general, es deseable tener al menos 100 eventos en la puerta de contacto final de la membrana.
