Identificación y enumeración de células inmunitarias en líquido de lavado broncoalveolar mediante citometría de flujo

Resumen

Fuente: Van Hoecke, L. et al., Lavado broncoalveolar de pulmones murinos para analizar la infiltración de células inflamatorias.J. Vis. Exp.(2017)

Este video demuestra el uso de la citometría de flujo para identificar y contar varias células inmunitarias en el líquido de lavado broncoalveolar. Inicialmente, las células inmunitarias individuales se identifican utilizando un colorante de viabilidad, seguido de la tinción diferencial de las proteínas marcadoras de superficie, lo que permite la enumeración precisa de cada tipo de célula.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación

1. Líquido de lavado
   1. Prepare una solución salina balanceada con 100 μM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
      nota: Para medir los niveles de proteínas en el líquido de lavado broncoalveolar (BAL), se recomienda agregar inhibidores de la proteasa para prevenir la actividad de la proteasa en el líquido BAL.
2. catéter
   1. Haga un catéter insertando una aguja de 23 G en un tubo de plástico transparente de polietileno 21 G (diámetro interior: 0,58 mm, diámetro exterior: 0,965 mm y longitud: 0,5 cm). También se pueden usar catéteres prefabricados.
3. Anestésicos
   1. Prepare un anestésico terminal, preferiblemente uno que cause un paro respiratorio (por ejemplo, una solución de barbitúrico similar a la de pentobarbital sódico (>100 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS)><). nota: Se recomienda utilizar anestesia inyectada en lugar de anestesia inhalada, ya que la anestesia inhalada puede influir en el contenido de líquido BAL. El_CO2, por ejemplo, influye en el pH de la sangre y, en consecuencia, en la redistribución de diferentes compuestos.
4. Tampón de lisis de glóbulos rojos de cloruro-potasio (ACK)
   1. Prepare un tampón de lisis ACK disolviendo 8,29 g de cloruro de amonio (NH₄Cl) y 1 g de bicarbonato de potasio (KHCO₃) en 1 L de H₂O con 100 μM de EDTA; el tampón de lisis de glóbulos rojos también se puede comprar de una fuente externa.

>2. Realización del lavado broncoalveolar (BAL)

1. Introducción del catéter en la tráquea
   1. Eutanasia del ratón mediante inyección intraperitoneal de una dosis letal de un anestésico barbitúrico de acción corta utilizando una aguja de 26 G. Para confirmar la anestesia letal adecuada, pellizque la pata trasera del ratón con pinzas para verificar el reflejo del pie.
   2. Coloque al animal boca arriba sobre una placa quirúrgica y fije al ratón sujetando las extremidades.
   3. Rocíe etanol al 70% en el cuello para desinfectar. Haz una incisión en la piel del cuello cerca de la tráquea con un bisturí.
   4. Abra la piel para exponer las glándulas salivales. Separe las glándulas salivales usando pinzas para exponer el músculo esternohioideo. Incide el músculo alrededor de la tráquea con pinzas para exponer la tráquea.
   5. Coloque un hilo de algodón debajo de la tráquea con pinzas.
   6. Perfore con cuidado el centro de la tráquea expuesta entre dos anillos de cartílago con una aguja de 26 G. Tenga cuidado de no dañar más la tráquea.
   7. Inserte el catéter unos 0,5 cm en la tráquea. Asegúrese de que el catéter no se inserte demasiado en la tráquea, ya que esto puede provocar daños en la estructura pulmonar.
   8. Estabilice el catéter atando la tráquea alrededor del catéter con el hilo de algodón colocado en el paso 2.1.5. Si el catéter no está lo suficientemente atado, la solución salina balanceada inyectada puede fluir hacia la parte superior del tracto respiratorio en lugar de hacia los pulmones.
2. Recoja el líquido de lavado
   1. Cargue una jeringa de 1 mL con 1 mL de solución salina balanceada estéril con 100 μM de EDTA.
   2. Conecte la jeringa de 1 ml al catéter e inyecte suavemente la solución de sal/EDTA en el pulmón.
   3. Aspire la solución suavemente mientras masajea el tórax del ratón. Si el líquido aspirado no es visible en la jeringa, inserte con cuidado el catéter un poco más abajo o más arriba de la tráquea.
   4. Retire la jeringa de la aguja y transfiera el líquido de lavado recuperado a un tubo de 15 ml colocado sobre hielo. Normalmente, se recuperan 700 - 900 μL de BAL de 1 mL de solución inyectada.
   5. Repita los pasos 2.2.1 - 2.2.4 dos veces más.
      nota: Si el propósito es analizar el contenido no celular, se recomienda concentrar las muestras agrupadas cuando haya problemas de sensibilidad.

>3. Recolección de los componentes celulares y no celulares del líquido BAL

1. Centrifugar el líquido de lavado durante 7 minutos a 400 x g y 4 °C.
2. Recoja el sobrenadante y utilícelo inmediatamente para un análisis posterior (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, ELISA) o congele a -80 °C. Guarde la pastilla celular para analizar el flujo celular en los pulmones.
3. Vuelva a suspender el pellet de celda en 200 μL de tampón de lisado ACK.
   nota: Este paso asegura la lisis de los eritrocitos mientras se mantienen intactos los glóbulos blancos.
4. Incubar durante 2 min a RT.
   nota: Para reducir la variación causada por la lisis de los glóbulos rojos, este paso no debe realizarse durante más de 2 minutos.
5. Añadir 1 mL de PBS frío para diluir el tampón de lisado ACK.
6. Centrifugar durante 7 min a 400 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un volumen adecuado de PBS para el análisis posterior (ver más abajo).
   nota: El volumen del PBS depende del estudio posterior que se vaya a realizar.

>4. Análisis de los diferentes tipos de células en el líquido BAL mediante citometría de flujo

NOTA: Una posibilidad es analizar la composición celular absoluta y relativa del líquido BAL mediante la realización de citometría de flujo. El objetivo de este trabajo es profundizar en la técnica de la BAL, que es una técnica especializada en sí misma. Se recomienda leer trabajos especializados sobre la técnica de citometría de flujo. Se utilizan anticuerpos acoplados a un fluoróforo que reconocen antígenos de superficie (ver Tabla 1) específicos de un tipo o tipos de células en particular. Mediante el uso de una estrategia de compuerta, es posible identificar células T, macrófagos, células dendríticas, células B, eosinófilos y neutrófilos en la fracción celular del BAL.

1. Tinción de la superficie celular
   nota: Es importante incluir todos los controles críticos para el análisis de citometría de flujo. Se necesitan tres juegos de tubos (véase el Cuadro 2): (1) tubos que contienen las muestras; (2) tubos con células BAL para cada anticuerpo-fluoróforo para hacer tinciones individuales; Esto permite la determinación de los voltajes para cada canal en el citómetro de flujo; y (3) tubos con perlas para cada anticuerpo-fluoróforo para hacer tinciones individuales; Esto es para determinar la matriz de compensación.
   1. Realice una mezcla de los anticuerpos y el bloque Fc (anti-CD16/CD32) en PBS a las diluciones adecuadas (ver Tabla 2). Es necesario determinar la dilución de trabajo óptima para cada anticuerpo antes del experimento.
   2. Vuelva a suspender las células en 50 μL de la mezcla de anticuerpos para la muestra y agregue 50 μL del anticuerpo adecuadamente diluido a los controles críticos><. nota: La tinción se puede realizar en una placa en forma de U de 96 pocillos. Esto permite reducir fácilmente el volumen de la mancha y procesar cantidades significativas de muestras.
   3. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
   4. Centrifugar durante 7 min a 400 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante.
   5. Vuelva a suspender las células en PBS hasta un volumen final de 200 μL.
      nota: Este volumen final depende del volumen mínimo al que puede acceder el citómetro de flujo. Esto puede diferir ligeramente entre máquinas. Además, el volumen de lectura depende del número de células y/o del tiempo que tardará la muestra en funcionar en el citómetro de flujo.
   6. Utilice las muestras y los controles para el análisis de citometría de flujo.
      nota: Para determinar el número absoluto de celdas de las diferentes poblaciones de celdas, se deben agregar cuentas de conteo. Agregue el mismo número de cuentas (± 25,000 cuentas) a cada muestra justo antes de la medición. Mediante el uso de dispersión frontal y lateral, las perlas de recuento se pueden identificar mediante citometría de flujo (ver Figura 1). Posteriormente, el número absoluto de celdas en la muestra se puede calcular comparando la relación entre los eventos de cuentas y los eventos de celda. Se puede utilizar la siguiente fórmula:
      
2. Análisis de citometría de flujo
   nota: El análisis de citometría de flujo debe realizarse inmediatamente después de completar el protocolo de tinción. Se debe utilizar un citómetro de flujo con láseres y filtros apropiados para la detección de señales. La Tabla 3 ofrece una visión general de los láseres y filtros necesarios para el estudio descrito en este manuscrito. Para obtener más información sobre el análisis de citometría de flujo, consulte Adan et al.
   1. Configure las puertas primarias en función de la dispersión frontal y lateral, excluyendo escombros y dobletes (consulte la Figura 1).
   2. Ajuste el voltaje y la compensación para la superposición espectral con la ayuda de las celdas y perlas de tinción única.
      nota: Estos ajustes son diferentes para cada citómetro de flujo y deben comprobarse antes de cada experimento. Para un análisis de flujo correcto, los voltajes de dispersión directa y lateral son críticos. Una correcta dispersión frontal y lateral puede ayudar en la identificación y confirmación de la identidad de las células analizadas. Para determinar estos voltajes, primero se debe ejecutar una muestra sin teñir.
   3. Configure puertas de fluorescencia para el antígeno de superficie (consulte la Figura 1) y analice las muestras.

Tabla 1: Selección de antígenos de superficie de células inmunitarias. Esta tabla proporciona una lista de epítopos de superficie utilizados para caracterizar los diferentes tipos de células. Se requerirán combinaciones de varios marcadores para definir de manera confiable un tipo de célula específico.

antígeno	Tipo de célula
Clúster de diferenciación 3 (CD3)	Expresado en linfocitos T
Clúster de diferenciación 11c (CD11c)	Alta expresión en la mayoría de las células dendríticas, pero también en monocitos, macrófagos, neutrófilos y algunos linfocitos B.
Clúster de diferenciación 11b (CD11b)	Se expresa en la superficie de muchos leucocitos, incluidos monocitos, neutrófilos, células asesinas naturales, granulocitos y macrófagos.
SiglecF	Macrófagos alveolares y eosinófilos.
MHCII	Normalmente se encuentra solo en las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, los fagocitos mononucleares y las células B.
CD19	Antígeno de linfocitos B
Ly-6G	Marcador de monocitos, granulocitos y neutrófilos

Tabla 2. Lista de controles que se incluirán. Esta tabla muestra todos los controles necesarios para la interpretación precisa de los resultados obtenidos.

Muestras
tubo	Antígeno-fluoróforo que se añade a las células	Concentración de anticuerpos (mg/mL)	Dilución de anticuerpos	Volumen total (μL)
	Tinte de viabilidad fijable	0.2	1/1000	50
	CD11c	0.2	1/800	50
	SiglecF	0.2	1/100	50
muestra X	MHCII	0.2	1/200	50
	CD3	0.2	1/200	50
	CD19	0.2	1/200	50
	CD11b	0.2	1/200	50
	Ly6G	0.2	1/200	50
Controles de voltaje
tubo	Antígeno-fluoróforo que se añade a las células	Concentración de anticuerpos (mg/mL)	Dilución de anticuerpos	Volumen total (μL)
Células sin teñir	/	/	/	50
Células de una sola tinción	Tinte de viabilidad fijable	0.2	1/1000	50
Células de una sola tinción	CD11c	0.2	1/800	50
Células de una sola tinción	SiglecF	0.2	1/100	50
Células de una sola tinción	MHCII	0.2	1/200	50
Células de una sola tinción	CD3	0.2	1/200	50
Células de una sola tinción	CD19	0.2	1/200	50
Células de una sola tinción	CD11b	0.2	1/200	50
Células de una sola tinción	Ly6G	0.2	1/200	50
Controles de compensación
tubo	Antígeno-fluoróforo que se añade a las perlas	Concentración de anticuerpos (mg/mL)	Dilución de anticuerpos	Volumen total (μL)
Cuentas sin manchar	/	/	/	200
Cuentas de una sola mancha	CD11c	0.2	1/2000	200
Cuentas de una sola mancha	SiglecF	0.2	1/2000	200
Cuentas de una sola mancha	MHCII	0.2	1/200	200
Cuentas de una sola mancha	CD3	0.2	1/2000	200
Cuentas de una sola mancha	CD19	0.2	1/2000	200
Cuentas de una sola mancha	CD11b	0.2	1/400	200
Cuentas de una sola mancha	Ly6G	0.2	1/200	200

Tabla 3: Resumen de los láseres y filtros del citómetro de flujo utilizados en este estudio.

Tipo de láser	Configuración del filtro
	505 LP	525/50
Azul (488 nm)	550 LP	575/26
100 mW	670 LP	685/35
	750 LP	780/60
violeta 405 nm		450/50
100 mW
rojo 633 nm		660/20
70 mW	750 LP	780/60

Resultados

Figura 1: Estrategia de compuerta para la detección por citometría de flujo de macrófagos, células dendríticas, células T, células B, neutrófilos y eosinófilos en líquido BAL. Las células BAL se aislaron utilizando el protocolo BAL descrito. Las células se aislaron de ratones 24 h después de la instilación intratraqueal de lipopolisacárido. Las cuentas de conteo y las celdas se identificaron en funci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina equilibrada	Thermo Fisher Scientific	14175-129
Ácido etileendiaminatetra acético	Sigma-Aldrich	E6511	irritante
Aguja de 23G x 1 1/4	Henke Sass Lobo	4710006030	Tamaño: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Lobo	4710004512	Tamaño: 0,45*12 mm
Tubos de plástico	Tecnología médica BD	427411	Tubería de polietileno, diámetro interno de 0,58 mm (0,023") de diámetro exterior. 965 mm (0,38") 30,5 m (100')
Pentobarbital sódico	Kela NV	514
Solución salina tamponada con fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS sin Ca++, Mg++ o rojo de fenol; estéril filtrado
Jeringas de 1 ml	Henke Sass Lobo	5010.200V0	No pirogénico y no tóxico
fórceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Tijeras quirúrgicas	Fine Science Tools GmbH	91460-11
Tubo centrífugo 50 ml	ésimo. Geyer	7696705	Libre de ARNasa/Dnasa/endotoxina
Tubo centrífugo 15 ml	ésimo. Geyer	7696702	Libre de ARNasa/Dnasa/endotoxina
Tubo de microcentrífuga 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	polipropileno
Microcentrífuga	Sigma-Aldrich	5415R
centrífuga	Thermo Fisher Scientific	75004030
Tampón de lisado de cloruro-amonio y potasio (ACK)	Lonza	10-548E	Filtrado estéril
Vivo/muerto -efluor506	ebiociencia	65-0866-18	Tinte de viabilidad fijable
CD11c-PE-cy7	eBiociencias	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Bioleyenda	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiociencias	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Bioleyenda	127621
Cuentas de conteo absolutas	Life Technologies Europe B.V.	C36950
anti-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Placa de almacenamiento de 340 μl de 96 pocillos	halcón	353263	Fondo en V, polipropileno natural
Citómetro de flujo	BD Biociencias
catéter	BD Biociencias	393202