1. Configuración de ensayos MIC90 replicantes y no replicantes
- Inocular M. tuberculosis, M. bovis BCG o M. smegmatis a un OD580 de 0,01-0,1 y expandirlo a la fase media del registro (OD580 ~ 0,5) en Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol, 0,2% de dextrosa, 0,5% de albúmina y 0,085% de NaCl) o 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol y 10% de suplemento de OADC).
- Cultive M. tuberculosis y M. bovis BCG como cultivos de pie de ~ 20 ml en matraces de cultivo celular y M. smegmatis con agitación en tubos de centrífuga cónicos de polipropileno de fondo redondo (4 ml de cultivo) o de 50 ml (10-20 ml de cultivo). Incubar micobacterias patógenas a 37 °C con 20% deO2 y 5% de CO2, y M. smegmatis a 37 °C con 20% deO2.
- Establezca un experimento de tipo concentración mínima inhibitoria (MIC90) en condiciones de replicación y no replicación (Figura 1).
nota: Los agentes de prueba generalmente se analizan en duplicados o cuadruplicados para permitir probar 4 o 2 compuestos, respectivamente, por microplaca de 96 pocillos. Por ejemplo, en una placa de 96 pocillos, se puede analizar un agente de prueba en las filas A-D y otro en las filas E-H. El DMSO (vehículo) se encuentra en las columnas 1, 2 y 12, y la serie de dilución del agente de prueba va desde la columna 3 (concentración más baja) hasta la columna 11 (concentración más alta). Los ensayos de estilo MIC90 suelen emplear una serie de dilución de 2 veces. Existen numerosos modelos no replicantes disponibles para micobacterias y, con fines ilustrativos, estamos utilizando un modelo multiestrés de no replicación.
- Para el ensayo de replicación, distribuya 200 μl de células en 7H9-ADN a un OD580 de 0,01 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo claro.
- Para el ensayo no replicante, lavar las células dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,02% de tyloxapol y resuspender las células en un medio no replicante (0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4, 0,005% citrato de amonio férrico, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butirato; pH ajustado a 5,0 con 2 N NaOH).
- Diluir las células hasta un OD580 de 0,1 en un medio no replicante y añadirNaNO2 de un caldo 1 M recién preparado hasta una concentración final de 0,5 mM.
- Distribuya 200 μl de células a un diámetro exterior de580 de 0,1 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo claro.
nota: Prepare diluciones compuestas como soluciones madre de 100 veces en DMSO. Por lo tanto, una placa MIC típica que prueba el impacto de una molécula a una concentración final de 0,4-100 μg/ml requeriría soluciones madre de 0,04-10 mg/ml en DMSO.
- Añadir 2 μl de diluciones del agente problema 1 en las filas A-E y 2 μl de diluciones del agente problema 2 en las filas E-H. Homogeneizar.
- Agregue 2 μl de control de vehículo (generalmente DMSO) en los pozos de control, columnas 1, 2, 12 (filas A-H). Homogeneizar.
- Para cada experimento, incluya al menos un control positivo, como rifampicina, de 0,004 a 1 μg/ml (ensayo replicante) y/o de 0,08 a 20 μg/ml (ensayo no replicante)
nota: Se recomienda el uso de 6-bromo-1H-indazol-3-amina9 a razón de 0,1 a 25 μg/ml como compuesto de control que tiene actividad selectiva dependiente de NaNO2 en el modelo multiestrés de no replicación.
- Para los ensayos de replicación, incubar las microplacas a 37 °C con 20% deO2 y 5% de CO2 durante 7 días (M. tuberculosis y M. bovis BCG) o 1-48 horas (M. smegmatis). Para el modelo multiestrés de no replicación, incubar microplacas durante 7 días a 37 °C con 1% deO2 y 5% de CO2 (M. tuberculosis y M. bovis BCG).
>2. Inoculación de microplacas CARA
- En los puntos de tiempo en los que se utilizará el CARA como lectura, vuelva a suspender con cuidado el contenido del pocillo de la placa de ensayo estilo MIC90 con una pipeta multicanal p200 ajustada a 50-75 μl. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos 5-10 veces y agite suavemente el contenido del pocillo con movimientos circulares con las puntas de pipeta.
- Transfiera 10 μl del contenido del pocillo de ensayo a la microplaca CARA. Asegúrese de que el orden del contenido del pocillo en la placa de ensayo coincida con el orden del contenido del pocillo de la microplaca CARA. Evite salpicaduras durante las transferencias y asegúrese de que los 10 μl estén ubicados en el centro de los pocillos de la microplaca CARA. Confirme que los 10 μl se absorben en la microplaca CARA.
nota: No se requieren diluciones antes de detectar células en las microplacas CARA.
- Ata pilas de microplacas CARA con cinta adhesiva y luego colócalas en una bolsa de plástico con cierre. Incubar microplacas CARA a 37 °C con 20% deO2 (M. smegmatis) o 1% deO2 y 5% de CO2 (M. tuberculosis y M. bovis BCG).
- Para M. tuberculosis y M. bovis BCG, ensayos replicantes: incubar durante 7 días; para M. tuberculosis y M. bovis BCG BCG, incubar durante 10 días; para M. smegmatis, ensayos replicantes, incubar durante 1-2 días; para M. smegmatis, ensayos no replicantes, incubar 2-3 días><.
NOTA: Los tiempos son estimados y pueden modificarse en consecuencia para diferentes condiciones de replicación, no replicación y estrés.
>3. Desarrollo de microplacas CARA
- Desarrolle las microplacas CARA cuando una película de crecimiento bacteriano, o colonias macroscópicas más grandes, sean visibles en los pozos de control negativos (vehículo).
nota: Después de una incubación prolongada, los pocillos de microplacas CARA a menudo parecen secos y recomendamos humedecer previamente el contenido de los pocillos con PBS estéril. Esto sirve para evitar que el carbón absorba resazurina, lo que puede provocar una baja fluorescencia o una variación de pozo a pocillo.
- Utilizando un solo juego de 12 puntas p200 con una pipeta multicanal, dispense 40 μl de PBS estéril a lo largo del costado de los pocillos y permita que el PBS se distribuya por la parte superior de las microcolonias de agar/bacterias.
- Prepare el reactivo revelador CARA mezclando 5 mg de resazurina (0,01% final) y 50 ml de Tween-80 al 5% en PBS. Filtro de vórtice y estéril.
nota: Se puede preparar un reactivo de desarrollo CARA alternativo mezclando una solución líquida de resazurina preparada comercialmente a 1:1 (vol/vol) con 10% de Tween80 en PBS.
- Añada 50 μl de reactivo revelador CARA recién preparado a cada pocillo de la microplaca CARA con una pipeta de 12 canales. Balancee las placas de un lado a otro varias veces para ayudar a distribuir los reactivos a través del agar y la estera bacteriana en cada pozo.
- Coloque las placas en una bolsa de plástico con cierre hermético e incube a 37 °C durante al menos 30 min para M. smegmatis y 45-60 min para M. tuberculosis o M. bovis BCG.
nota: Si los pozos de control del vehículo no se vuelven rosados dentro de la primera hora, las placas se pueden volver a embolsar e incubar durante períodos de tiempo más largos.
- Antes de leer la fluorescencia, coloque las microplacas CARA en una capucha de bioseguridad durante 15 minutos a temperatura ambiente sin las tapas. Cuando utilice espectrofotómetros BSL3 fuera de un gabinete de bioseguridad, adhiera una etiqueta PCR de calidad óptica sobre la placa y selle herméticamente presionando suavemente la superficie de la etiqueta con una toalla de papel suave.
- Determine la fluorescencia a través de la lectura superior con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. No es necesario dejar la placa en blanco.
