1. Preparación de medios y reactivos
- Prepare los medios de fibroblastos. Combine 450 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 50 mL de suero fetal bovino (FBS) y 5 mL de penicilina/estreptomicina. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
- Prepare el medio de crecimiento de macrófagos reporteros en alícuotas de 50 mL. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 μg/mL de reactivo de eliminación de micoplasmas (Tabla de Materiales) y 200 μg/mL de fleomicina D1 (Tabla de Materiales). Almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
- Prepare los medios de ensayo de macrófagos reporteros en alícuotas de 50 mL. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS inactivado por calor (HI-FBS), 5 μg/mL de reactivo de eliminación de micoplasma y 200 μg/mL de fleomicina D1. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
>2. Recubrimiento de superficies de cultivo celular con poli(metacrilato de metilo)
- Disuelva el poli(metacrilato de metilo) (PMMA) en cloroformo a 20 mg/mL (por ejemplo, 100 mg de PMMA en 5 mL de cloroformo) en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. Coloque una barra de agitación magnética en el vial y deje remover durante al menos 2 h, hasta que todos los sólidos se disuelvan.
cautela: El cloroformo es dañino si se inhala. Asegúrese de usar solvente en una campana extractora mientras usa guantes de PVA.
- Pipetear 400 μL de solución de PMMA en el centro de un portaobjetos de microscopio de vidrio de borosilicato en un recubridor de centrifugación y centrifugar a 3000 rpm durante 2 min. Prepare el número de portaobjetos necesarios para el ensayo, así como 3-5 adicionales para la medición del ángulo de contacto con el agua. Guarde los portaobjetos en una caja limpia (rociada y limpiada con etanol al 70%) para uso futuro.
nota: El recubrimiento giratorio se usa a menudo para depositar una capa delgada y uniforme sobre una superficie plana. Un recubridor giratorio gira un sustrato a altas velocidades, utilizando la fuerza centrífuga para esparcir la solución de recubrimiento sobre la superficie.
- Mida el ángulo de contacto con el agua en dos posiciones aleatorias en la superficie de los portaobjetos con recubrimiento adicional (es decir, no los portaobjetos que se utilizan para el cultivo celular) con un goniómetro para asegurarse de que la superficie del vidrio esté completamente recubierta con el polímero><.
NOTA: Solo se debe usar agua de la más alta pureza (por ejemplo, vidrio destilado tres veces) para las mediciones del ángulo de contacto con el agua.
- En una cabina de seguridad biológica (BSC), fije pocillos adhesivos de 8 cámaras a portaobjetos recubiertos de PMMA utilizando pinzas estériles y siguiendo la técnica aséptica. Presione firmemente la parte superior de los pocillos pegajosos para asegurarse de que estén bien adheridos. Incube los portaobjetos con pocillos adhesivos adjuntos a 37 °C durante la noche para asegurar el sello.
- Pruebe el sellado de los pocillos pegajosos agregando 200 μL de agua de grado de cultivo celular (libre de endotoxinas) a cada pocillo. Incube a temperatura ambiente (RT) durante 60 minutos y asegúrese de que no haya fugas antes de continuar. Aspire el agua, teniendo cuidado de no alterar el recubrimiento de PMMA.
- Realice lavados con agua libre de endotoxinas agregando 300 μL de agua libre de endotoxinas a cada pocillo e incubando durante 1 h (tres veces), 12 h y 24 h antes de usar para eliminar cualquier solvente restante.
- Analice la concentración de endotoxinas de los portaobjetos que se utilizarán para el cultivo celular. Incubar 200 μL de agua reactiva libre de endotoxinas (Tabla de Materiales) en un pocillo de cada portaobjetos durante 1 h. Mida la concentración de endotoxinas en el extracto utilizando un ensayo de endotoxinas cromogénicas de punto final (Tabla de materiales).
nota: El siguiente protocolo es específico para el kit de ensayo de endotoxinas que se enumera en la Tabla de Materiales.
- Utilice únicamente agua y consumibles (es decir, puntas de pipeta, tubos de microcentrífuga y placas de pocillos) que estén certificados como libres de pirógenos (es decir, libres de endotoxinas) para este trabajo. Además, cualquier cristalería utilizada en la preparación de las superficies recubiertas de polímeros debe despirogenarse mediante esterilización por calor seco (250 °C durante 30 min) antes de su uso. La medición de la endotoxina en la solución del extracto, como se describe aquí, puede resultar en una subestimación de la endotoxina en la superficie del material. En consecuencia, se recomienda que al desarrollar un protocolo de recubrimiento de polímeros, realice la reacción de ensayo de endotoxinas (es decir, los pasos 2.6.4-2.6.6 para muestras de prueba [agua reactiva] o controles de picos) directamente dentro de los pocillos que contienen la muestra recubierta para garantizar que no se introduzcan inadvertidamente fuentes de endotoxinas en el sistema durante el proceso de recubrimiento.
- Lleve todas las muestras de prueba (es decir, extractos) y los reactivos de ensayo de endotoxinas a RT. Reconstituya el reactivo cromogénico en el tampón de ensayo y el estándar de endotoxinas en agua de reactivo, deje que se disuelva durante 5 minutos y revuelva suavemente antes de usar. Cubra todas las botellas con una película de parafina cuando no estén en uso.
- Cree una curva de dilución estándar de 5 a 8 puntos del patrón de endotoxina que vaya desde el límite inferior hasta el superior del ensayo realizando una dilución en serie del patrón de endotoxina en agua reactiva.
- Para controlar el aumento o la inhibición del ensayo de endotoxinas en las muestras de prueba, prepare un control positivo (también llamado control de pico o muestra con pico) diluyendo una cantidad conocida de endotoxina en una solución de muestra de prueba no utilizada><.
nota: La concentración del control positivo debe ser la misma concentración que la de un patrón en el centro de la curva estándar. Si la cantidad recuperada de la espícula de endotoxina (es decir, la concentración del control positivo menos la concentración de la muestra de prueba sin espiga) está dentro del 50-200% de la concentración nominal de la espiga de endotoxina, se puede considerar que la solución de extracción no interfiere significativamente con el ensayo.
- Agregue 50 μL de estándares, muestras o controles de pico a cada pocillo de una placa de 96 pocillos por duplicado o triplicado. Utilice el agua reactiva como control negativo.
- Agregue 50 μL de reactivo cromogénico a cada pocillo. Agregue reactivo rápidamente a todos los pocillos. Utilice un temporizador para registrar la cantidad de tiempo que se tarda en añadir reactivo a todos los pocillos. Cubra la placa con un sello adhesivo e incube a 37 °C (el tiempo de incubación depende del lote y se indica en el certificado de análisis incluido en el kit de reactivos cromogénicos). Alternativamente, revise la placa cada 15 minutos durante la incubación hasta que se observe un cambio de color en todos los pocillos estándar.
- Después de la incubación, agregue 25 μL de ácido acético al 50% a cada pocillo (concentración final de 10% de ácido acético por pocillo) para detener la reacción. Agregue ácido acético en el mismo orden en que se agregó el reactivo cromogénico. Lea la absorbancia de la placa utilizando un lector de placas a 405 nm. Aspire el líquido y deseche la placa.
nota: La adición de ácido acético debe tardar el mismo tiempo que el reactivo cromogénico (± 30 s).
- Esterilizar los portaobjetos con ultravioleta (UV) durante 30 minutos antes de los experimentos de cultivo celular.
>3. Fabricación de lisado a partir de células 3T3
- Cultive células 3T3 en múltiples matraces T150 hasta una confluencia del 70%. Para separar las células, aspire los medios, lave la superficie con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y aspire PBS. Añadir 5 mL de enzima de disociación celular recombinante libre de origen animal (Tabla de Materiales) e incubar a 37 °C durante 3-5 min.
- Separe las celdas inclinando suavemente el matraz hacia adelante y hacia atrás. Añadir 5 mL de PBS para neutralizar la enzima recombinante utilizada para la disociación celular. Transfiera las células separadas de los matraces a un tubo de centrífuga y mezcle mediante pipeteo. Realizar un recuento de células vivas utilizando un hemocitómetro y un colorante de viabilidad celular.
nota: Se seleccionó una enzima de disociación celular que puede neutralizarse mediante dilución en PBS para evitar la introducción de proteínas basadas en suero en la preparación del lisado. Si se usa tripsina para disociar las células, debe neutralizarse con una solución que contenga suero, y se debe realizar un lavado adicional de PBS para reducir la cantidad de proteínas séricas transportadas a la preparación de lisado.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el volumen original (es decir, 10 ml x número de matraces) de PBS para lavar los medios restantes. Repetir.
- Centrifugar las células de nuevo a 200 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Agregue el volumen de PBS requerido para lograr una concentración final de células de 1 x 106 células/mL. Coloque la solución celular en un congelador de -80 °C hasta que la muestra esté completamente congelada (al menos 2 h).
- Descongele la solución celular en un baño de agua a 37 °C. Una vez completamente descongelada, vuelva a colocar la solución en el congelador a -80 °C hasta que esté totalmente congelada. Repita durante un total de 3 ciclos de congelación y descongelación.
- Realice un ensayo de ácido microbicinconínico (BCA) en el lisado celular en una variedad de diluciones (por ejemplo, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) para determinar la concentración de proteínas. Diluir el lisado celular hasta una concentración de proteína de 468,75 μg/mL, alícuota, y almacenar a -80 °C para uso futuro.
nota: La concentración final de proteína en una placa de 48 pocillos es de 125 μg/cm2 (basada en la superficie de un pocillo, 0,75cm2).
- Realice una transferencia de Western para evaluar la presencia de DAMP en el lisado (p. ej., proteína de choque térmico 60 [HSP60], caja de grupo de alta movilidad 1 [HMGB1]) cargando 40-60 μg de proteína de lisado en tampón de carga en un gel de poliacrilamida al 10% de 1,5 mm de espesor y siga los procedimientos estándar de transferencia occidental.
>4. Evaluación del efecto de las capas de proteínas adsorbidas y los receptores tipo Toll sobre la actividad NF-κB de los macrófagos
NOTA: Para obtener un esquema del flujo de trabajo experimental y el diseño de placas, consulte la Figura 1A y la Figura 2, respectivamente.
- Cultive macrófagos reporteros en un matraz de tamaño adecuado hasta un 70% de confluencia. Aspire medios, lave la superficie con PBS y aspire PBS. Añadir la enzima de disociación celular recombinante e incubar a 37 °C durante 8 min.
- Separe las células golpeando firmemente los lados del matraz. Inactive la enzima de disociación de células recombinantes agregando un volumen igual de medio de crecimiento (que contenga 10% de FBS). Realizar un recuento de células vivas utilizando un hemocitómetro y un colorante de viabilidad celular.
nota: La viabilidad esperada para los macrófagos reporteros después de una incubación de 8 minutos en la enzima de disociación celular es del 90%.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en el volumen original de PBS para lavar las células. Centrifugar de nuevo y resuspender las células a 7,3 x 105 células/ml en un medio de ensayo (que contiene FBS inactivado por calor).
- Separe la suspensión celular en 3 tubos diferentes: inhibidor de TLR4, anti-TLR2 y sin tratar. Incubar las células con 1 μg/mL de inhibidor de TLR4 durante 60 min en RT o con 50 μg/mL de anti-TLR2 durante 30 min en RT.
- Agregue 200 μL de lisato, 10% de FBS, 10% de plasma de ratón comercial (Tabla de Materiales) o una mezcla de las soluciones de proteína a una placa de 48 pocillos (o equivalente) y deje que la proteína se adsorba a 37 °C durante la cantidad de tiempo deseada (es decir, 30 min, 60 min o 24 h). Aspire las soluciones de proteínas de los pocillos, utilizando una pipeta Pasteur nueva para cada solución de proteína, y lave las superficies con 250 μL de PBS durante 5 min. Repita para un total de 3 lavados.
nota: Es posible que este paso deba iniciarse antes en el protocolo, dependiendo del tiempo de adsorción deseado. Ajuste el protocolo en consecuencia.
- Después del período de incubación con el inhibidor de TLR4 o anti-TLR2, pipetear las células para resuspender. Agregue 200 μL de solución celular a cada pocillo.
- Para la condición de control positivo de TLR2, agregue Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) hasta una concentración final de 150 ng/mL. Para la condición de control positivo de TLR4, agregue lipopolisacárido (LPS) hasta una concentración final de 1,5 μg/mL. Incubar las células a 37 °C durante 20 h.
- Muestree 20 μL de sobrenadante de cada pocillo y placa por duplicado en una placa de 96 pocillos. Incluya tres pocillos de 20 μL de medio de ensayo como control de fondo. Añada 200 μL de reactivo de ensayo SEAP a cada pocillo. Cubra la placa con un sello adhesivo e incube durante 2,5 h a 37 °C.
nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo de las condiciones experimentales, y debe optimizarse para una fuerte diferencia en la absorbancia entre los pocillos de control positivo y negativo.
- Transfiera el resto del sobrenadante a un tubo de 1,5 mL (por pocillo). Centrifugar a 1.000 x g durante 10 min para pellet cualquier residuo. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y guárdelo a -80 °C. Analice el sobrenadante para detectar la presencia de citocinas proinflamatorias (p. ej., factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina 6) mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA).
- Retire el sello de la placa adhesiva. Lea la absorbancia de la placa utilizando un lector de placas a 635 nm. Aspire el líquido y deseche la placa.
