1. Generación de lentivirus que codifica CAR
NOTA: Una vez que se completa la construcción del plásmido de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) específico (CD47 y otros), los CAR lentivirales se generan mediante el procedimiento estándar, utilizando 293 células FT, una mezcla de empaquetamiento lentiviral y agentes de transfección (consulte la Tabla de Materiales) como se describe. Posteriormente, utilice un kit cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y un termociclador (consulte la tabla de materiales) para determinar el título del virus midiendo la cantidad de ARN lentiviral de acuerdo con el protocolo del fabricante. Es importante que todos los procedimientos lentivirales se lleven a cabo siguiendo estrictamente los requisitos de seguridad.
- Siembre 15 x 106 6 células HEK293FT en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e incube las células durante la noche a 37 °C en un plato de 150 mm dentro de una incubadora humidificada de dióxido de carbono (CO2) al 5%.
- Prepare dos tubos de 15 mL con complejo de transfección. El primer tubo contiene ADN plasmídico de vector lentiviral (5 μg) y mezcla de empaquetamiento lentiviral (22,5 μg) en 2,5 mL de solución de dilución de transfección. El segundo tubo contiene 82,5 μL de reactivo de transfección en 2,5 mL de solución de dilución de transfección (consulte la Tabla de materiales).
- Pipetear el contenido del tubo 1 en el tubo 2 e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.
- Transfiera el contenido del tubo gota a gota a la placa de HEK293FT células e incube la muestra durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% y CO2.
- Al día siguiente, sustituya el medio existente por 19 ml de medio de cultivo DMEM fresco y continúe incubando las células durante la noche dentro de la incubadora humidificada deCO2 al 5% a 37 °C.
- Transfiera el medio de la placa a un tubo de centrífuga de 50 ml. Mantenga el tubo con el medio que contiene el virus en el refrigerador.
- Repita el procedimiento anterior, agregando DMEM fresco y recolectándolo nuevamente después de 1 día.
- Combine dos colecciones de medios en un tubo de centrífuga. Centrifugar el tubo a 2.000 x g durante 30 min a 4 °C.
- Transfiera la mayor parte del sobrenadante que contiene lentivirus a un tubo centrífugo ultratransparente. Deje un volumen mínimo, alrededor de 1 mL del sobrenadante para evitar perturbar el pellet que pueda contener células y/o residuos.
- Ultracentrifugar el sobrenadante clarificado anteriormente a 110.000 x g durante 100 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante con cuidado y agregue suavemente 100 μL de medio DMEM al gránulo de virus en la parte inferior del tubo. Deje el tubo en hielo durante 15 min. Mezcle la solución suavemente y alícuota la solución de lentivirus en tubos estériles preenfriados. Almacene estos tubos de material de virus en un congelador a -80 °C.
- Utilice un kit de RT-PCR cuantitativo para determinar el título del lentivirus de acuerdo con el protocolo del fabricante, que extrae y mide el ARN lentiviral.
>2. Generación y expansión de células CAR-T
- Activar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) previamente congeladas (aproximadamente 1 x 106 a 2 x 106 células) en 1 ml de medio de células T con CAR con un número igual de microperlas recubiertas de CD3/CD28 (consulte la Tabla de materiales) e incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada de CO2 al 5% durante 24 h.
- Descongelar una alícuota de las existencias de lentivirus en hielo.
- Agregue 1 μL de agente de mejora de transducción en el pocillo con las celdas y mezcle.
- Agregue lentivirus a las células con una multiplicidad de infección (MOI) de 5:1 y mezcle suavemente. Al día siguiente, repita este paso (24 horas después de la primera transducción).
- Controle el crecimiento de las células T cada 2-3 días. Agregue más medio fresco de células T con CAR para mantener las células a una densidad de 1 x 106 a 2 x 106 células/mL.
- Congele las células T con CAR con un protocolo estándar utilizando una solución de congelación (consulte la Tabla de materiales).
- Descongele las células T con CAR utilizando un método estándar y precultive en el medio de células T con CAR durante aproximadamente ~ 2-4 h con interleucina-2, IL-2 (300 unidades/mL) antes de aplicarlas al ensayo.
>3. Detección de la expresión de CAR por citometría de flujo
- Transfiera 3 x 105 células T con CAR y células T no transducidas a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml separados.
- Centrifugar los tubos a 300 x g durante 2 min y resuspender las células en 200 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) que contiene un 1% de suero humano.
- Pipetear 100 μL de solución celular en dos tubos de poliestireno FACS de 5 mL y mantener los tubos en hielo durante 5 min.
- Añadir 1 μL de F(ab')2 biotinilado anti-ratón de cabra a un tubo de cada tipo de célula. A continuación, añada 2 μL de ficoeritrina, un anticuerpo anti-marca marcado con PE (consulte la Tabla de materiales) al otro tubo de cada tipo de célula. Mezclar bien e incubarlos en hielo durante 30 min.
- Lave las células con 3 mL de tampón FACS en cada tubo y centrifugue los tubos a 300 x g durante 5 min; deseche los sobrenadantes y el vórtice muy brevemente o agite los tubos brevemente para resuspender las células en el líquido residual.
- Agregue 2 μL de células presentadoras de antígenos (APC) anti-CD3 y 2 μL de solución de anticuerpos 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) a cada tubo. En el tubo de células teñidas con anti-F(ab')2 Ab, agregue 1 μL de estreptavidina marcada con PE. Mezclar brevemente e incubar los tubos en hielo durante 30 min más.
- Utilice el tampón FACS para lavar las células de nuevo como se describe en el paso 3.5 y añada 200 μL adicionales de tampón FACS a cada tubo.
- Utilice la citometría de flujo para analizar las células mediante la activación primero de las células T en un diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral y, a continuación, la activación de las células vivas (7-AAD-negativas) en una gráfica CD3 frente a 7-AAD. El paso final es analizar anti-tag, anti-ScFv o anti-F(ab')2 frente a CD3.
>4. Ensayo de potencia de citólisis en tiempo real (RTCA)
NOTA: Realice el ensayo RTCA de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. En resumen, primero coloque las células objetivo en los pocillos de la placa E, seguido de la adición de células CAR-T al día siguiente. La actividad de citólisis de las células CAR-T frente a las células diana se monitoriza en tiempo real. Los linfocitos T y los linfocitos T con transducción simulada (linfocitos T con CAR simulados) se utilizan como controles de células efectoras negativas. El siguiente protocolo describe un ensayo de potencia de citólisis en tiempo real in vitro para líneas celulares tumorales adherentes.
- Añada 100 μL de medio de cultivo celular objetivo a cada pocillo de la placa E de xCELLigence, coloque la placa dentro del instrumento xCELLigence y realice una lectura de fondo. A continuación, transfiera la placa E a una campana de cultivo de tejidos para la siembra de células.
- Utilice un protocolo estándar para tripsinizar las células cancerosas objetivo del dispositivo de cultivo. A continuación, transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 mL y añada un medio de cultivo fresco, hasta 15 mL. Granular las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g. Deseche el sobrenadante, agregue 5 mL de medio fresco y use una pipeta serológica para resuspender suavemente el pellet celular. Cuente la densidad de células vivas con un hemocitómetro y un microscopio.
- Ajuste la densidad de celdas adecuadamente y luego agregue 100 L de la suspensión de celdas a cada pocillo de la placa E. El número de células objetivo suele ser de alrededor de 10.000 células/pocillo para las líneas celulares adherentes (BxPC3, Hela-CD19 y SKOV3), o 30.000 células/pocillo para las células en suspensión como Raji (consulte a continuación los detalles sobre el prerrecubrimiento de los pocillos con anticuerpos para atar las células cancerosas líquidas).
- Equilibre la placa E a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las celdas se asienten uniformemente en el fondo del pozo (esto es fundamental; no omita este paso).
- Coloque la placa E en el instrumento xCELLigence dentro de la incubadora de cultivos celulares y comience a medir la impedancia, que se muestra como índice celular frente al tiempo, automáticamente cada 15 minutos.
- Al día siguiente, prepare células CAR-T efectoras. Asegúrese de preparar los controles adecuados (es decir, células T con CAR simuladas, células T de control no transducidas y/o células T con CAR no relacionadas) con anticipación para asegurarse de que todas las células estén listas al mismo tiempo. Ajuste las celdas efectoras y las celdas de control a la densidad adecuada, y prepare diluciones en serie para garantizar que se logren las proporciones E:T deseadas cuando se agreguen 100 μL de suspensión de celdas efectoras a cada pocillo en el paso 9.
- Pause la adquisición de datos xCELLigence y lleve la placa E de la incubadora a una campana de cultivo celular.
- Retire 100 μL de medio de cada pocillo. La cantidad de medio residual en cada pocillo es ahora de 100 μL.
- Añada 100 μl de células CAR-T efectoras diluidas en serie u otras células de control (es decir, células CAR-T simuladas) para lograr las proporciones E:T deseadas.
- Equilibre la placa E a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células efectoras se asienten y, a continuación, vuelva a colocar la placa E en el instrumento xCELLigence. Reanudar la adquisición de datos.
- Si así lo desea, en puntos clave se puede pausar la adquisición de datos de xCELLigence y retirar la placa para recolectar muestras pequeñas que se analizarán mediante ensayos ortogonales (es decir, medición de la producción de citocinas mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) o citometría de flujo).
- En el experimento de células T CAR EGFR-GITR-CD3, mida el rendimiento de interferón-gamma (IFNγ) con un kit ELISA (siga las instrucciones del fabricante; consulte la Tabla de materiales)
nota CON RESPECTO AL USO DE CÁNCERES LÍQUIDOS: Para analizar las células cancerosas hematológicas no adherentes, antes de agregar las células, los pocillos de la placa E primero se recubren con un anticuerpo que es específico para un antígeno que se expresa en la superficie de las células cancerosas. Para la línea de células B de Raji, se utiliza un reactivo de anclaje basado en anti-CD40 (véase el kit de ensayo líquido para la eliminación de tumores en la Tabla de materiales). A continuación se muestra el procedimiento para recubrir la placa:
- Diluir el reactivo de anclaje (anti-CD40) con tampón de anclaje hasta una concentración de 4 μg/mL.
- Trabajando dentro de una campana de cultivo de tejidos, agregue 50 μL del reactivo de anclaje diluido a cada pocillo de la placa E. Deje la placa E a temperatura ambiente o en una incubadora a 37 °C durante 3 h.
- Retire el reactivo de anclaje y lave la placa E al menos 2 veces con tampón de lavado. En este punto, la placa E está lista para sembrar las células objetivo Raji (30.000 células/pocillo).
- Continúe con el paso 4.1 (arriba) para realizar el resto del procedimiento.
