Un método in vitro para determinar la actividad antiapoptótica de los anticuerpos contra el TNFα

Resumen

Fuente: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. Determinación de la potencia relativa de un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TNF mediante la neutralización del TNF mediante un método bioanalítico in vitro. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra una técnica para evaluar la eficacia de los anticuerpos contra el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), una citocina inflamatoria, a través de un enfoque bioanalítico in vitro. El TNFα, cuando se introduce en las células estresadas, desencadena la apoptosis. Sin embargo, la unión a los anticuerpos confina el TNFα, evitando la apoptosis. El grado de apoptosis se cuantifica mediante un ensayo de bioluminiscencia.

Protocolo

1. Preparación de los medios y soluciones

1. Preparar el medio de cultivo: RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS), pH 7.4.
2. Preparar medio de cultivo de ensayo: RPMI-1640 sin rojo fenol pero con 1% de FBS, pH 7.4.
3. Prepare la solución de lavado celular: solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin Mg y Ca con 0,02% de EDTA, pH 7,4.
4. Preparar solución de desprendimiento celular: tripsina al 0,125% con 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
   1. Descongele 100 mL de una solución al 0,25% de tripsina-EDTA y transfiéralo a un matraz estéril de 500 mL.
   2. Mezclar con 100 mL de solución de lavado celular y dispensar 15 mL de alícuotas en tubos estériles de 15 mL. Conservar entre -70 y -80 °C hasta su uso.
   3. Filtre estas soluciones a través de una membrana de 0,22 μm y caliente hasta 37 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso.
5. Preparar solución madre de inducción de apoptosis, solución de TNFα a 3,3 μg/mL.
   1. Disuelva 20 μg de TNFα con 500 μL de agua esterilizada con filtro en su recipiente primario y mezcle hasta la disolución completa.
   2. Transfiera a un tubo estéril de 15 mL y agregue 5.5 mL de solución libre de DPBS, Mg y Ca a este tubo. Mezcle suavemente con una batidora de vórtice.
   3. Alícuota la solución en porciones de 70 μL. Dispensar cada alícuota en microtubos de 0,5 ml y almacenar a -80 °C.
6. Preparar la solución de inducción de la apoptosis: Solución de TNFα a 40 ng/mL.
   1. Descongelar una alícuota de la solución madre de inducción de apoptosis, incubándola en un baño de agua a 25 °C durante 10 min.
   2. Diluir la solución madre de inducción de apoptosis a 40 ng/mL añadiendo 61 μL de solución de TNFα de 3,3 μg/mL a 4,939 mL de medio de cultivo de ensayo en un tubo estéril de 15 mL.
   3. Mezcle con un mezclador de vórtice durante 10 segundos; esta solución debe prepararse fresca antes de usarla.
   4. Calentar la solución a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de utilizarla en el ensayo de neutralización.
7. Prepare la solución de sustrato: solución de caspasa 3/7 Glo.
   1. Descongele la solución tampón de caspasa (tampón caspasa 3/7 Glo) durante 12 horas antes de usar.
   2. Deje reposar la solución tampón de caspasa y el sustrato (sustrato de caspasa 3/7 Glo) por separado a 25 ± 5 °C durante 30 minutos antes de mezclar.
   3. Transfiera 10 mL de la solución tampón de caspasa al vial de sustrato y mezcle por inversión.
   4. Mantener a 25 ± 5 °C, protegido de la luz hasta su uso.
      nota: La solución es estable durante 6 h a temperatura ambiente.

>2. Cultivo y conteo de células

1. Descongelación celular y el primer subcultivo.
   1. Retire un vial con células WEHI 164 de un congelador a -80 °C y transfiéralo a un baño de hielo.
   2. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con 1 mL de medio de cultivo precalentado hasta que las células congeladas se descongelen por completo.
   3. Dispensar 9 mL de medio de cultivo precalentado en un tubo estéril de 15 mL.
   4. Transfiera la suspensión celular al tubo estéril de 15 ml y mezcle suavemente cinco veces por inversión.
   5. Centrifugar la suspensión celular a 125 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y disgrege la célula granulable.
   6. Agregue 5 mL de medio de cultivo al tubo. Mezclar hasta que las células se resuspendan por completo.
   7. Para el recuento de células, transfiera 50 μL de la suspensión celular a un microtubo de 500 μL y mezcle con 50 μL de azul de tripán al 0,4%. Cuente las celdas y ajústelas a 0.5 x 10⁶ celdas/mL. Consulte el paso 2.2, a continuación.
   8. Añadir 13 mL de medio de cultivo precalentado a un matraz de cultivo celular de 75 mL.
   9. Dispensar suficiente volumen de suspensión celular del paso 2.1.6 para lograr 0,5 x 10⁶ células/mL en el matraz de cultivo celular e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche.
2. Recuento de células.
   1. Usando la solución del paso 2.1.6, transfiera 0,05 mL a un hemocitómetro y determine la densidad celular bajo un microscopio usando exclusión de azul de tripano.
   2. Cuantificar el número total de células y células viables.
   3. Ajuste las suspensiones de celdas a 0.5 x 10⁶ celdas/mL.
      V_{medio de cultivo} (mL) =
      _{Medio de cultivo} V (mL) = (5mL - Suspensión de_células V)
      _{Medio de cultivo} V (mL) = Volumen ajustado de suspensión celular WEHI 164
      NVC = Número de células WEHI 164 viables/mL
      V_{medio de cultivo} (mL) = Volumen del medio de cultivo de ensayo añadido a la suspensión celular para lograr 0,5 x 10⁶ células/mL
      0,5 x 10⁶ = Densidad de células objetivo
3. Desprendimiento celular y el segundo y tercer subcultivos.
   nota: Se puede utilizar un sistema de vacío para eliminar las soluciones de los matraces. Se pueden utilizar pipetas desechables o estériles de vidrio. Si la pipeta tiene una obstrucción de algodón en la parte superior, debe retirarse antes de usarla.
   1. Retire el medio de cultivo del matraz en T de cultivo celular con una pipeta estéril de 1 ml y una aspiradora.
   2. Dispensar 5 mL de solución de lavado celular en el matraz en T de cultivo, mezclar suavemente y desechar la solución. Repita este paso dos veces.
      nota: La eliminación completa del medio de cultivo es fundamental para un desprendimiento eficiente de las células.
   3. Añadir 15 mL de solución de desprendimiento de células al matraz T y dejar reposar durante 3 min en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   4. Verifique la ausencia de células adheridas en la pared interna del matraz bajo el microscopio. Extraiga las células del matraz en T de cultivo con una pipeta estéril de 20 mL y dispense en un tubo estéril de 50 mL.
   5. Centrifugar la suspensión celular a 125 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con otros 5 mL de medio de cultivo.
   6. Cuente las células y agregue suficiente medio de cultivo para alcanzar la concentración celular deseada de acuerdo con la Ecuación 1.
   7. Añadir esta suspensión a un matraz en T de 72^cm2 e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
   8. Subcultive las células al menos dos veces antes de utilizarlas en el ensayo de neutralización. Repita los pasos 2.3.1 a 2.3.8 durante los dos días siguientes.
4. Suspensión celular de ensayo.
   1. Seleccione una subcultura WEHI 164 que tenga al menos tres pases. Consulte el paso 2.1.
   2. Separe y cuente las celdas de acuerdo con los pasos 2.2 y 2.3 de este protocolo.
   3. Diluir la suspensión celular de acuerdo con la Ecuación 1 a 0.5 x 10⁶ células/mL.
   4. Utilice esta suspensión celular para el ensayo de neutralización. Mezcle todas las suspensiones celulares con un mezclador de vórtice antes de usar.

>3. Preparación y diluciones de anticuerpos

1. Cuantificación de los mAbs.
   1. Determine la concentración de la sustancia de referencia, la muestra de control y la muestra analítica mediante la absorción UV a 280 nm utilizando su coeficiente de extinción masiva (1,39).
      nota: Las concentraciones originales podrían tomarse de las etiquetas de los productos farmacéuticos. Sin embargo, esto debe verificarse mediante la absorción de rayos UV.
2. Diluciones de mAb.
   1. Diluir todas las muestras de forma independiente por triplicado, con una solución sin Mg y Ca de DPBS en microtubos de 2 mL, hasta 2 mg/mL. Confirme esta concentración por absorción UV por triplicado, utilizando una solución libre de DPBS, Mg y Ca, como blanco.
   2. Mezcle las soluciones de proteína madre durante 5 segundos con un mezclador de vórtice.
   3. Diluir 100 μL de cada solución de 2 mg/mL de mAb con 0,9 mL del medio de cultivo del ensayo.
   4. Mezclar durante 5 s con un mezclador de vórtice.
      nota: Estas soluciones tienen una concentración de 200 μg/mL. Se deben hacer diluciones para cada triplicado.
   5. Diluir 10 μL de cada solución de 200 μg/mL de mAb con 0,99 mL del medio de cultivo del ensayo. Mezcle durante 5 s con un mezclador de vórtice. Estas soluciones tienen una concentración de 2 μg/mL. Realice diluciones seriadas para cada triplicado antes de usarlos en el ensayo de neutralización.
   6. Realice diluciones de mAb anti-TNFα en tres microplacas independientes. Haga un duplicado de cada triplicado independiente y dispense en una microplaca, como se indica en la Tabla 1. Sustancia de referencia
   7. Realizar diluciones de mAb de cada referencia, muestra o control, como se muestra en la Tabla 2.
      nota: Las concentraciones de mAb anti-TNFα descritas en esta tabla no son las concentraciones finales en el ensayo de neutralización.
   8. Mantenga las placas a 25 ± 5 °C hasta su uso.

>4. Ensayo de neutralización con células WEHI 164

1. Mezcle mediante vórtice todas las suspensiones celulares (0,5 x 10⁶ células/mL) antes de dispensar en cualquier paso de este protocolo.
   nota: En esta sección, caliente cada solución a 37 °C durante 30 minutos antes de usarla.
2. Transfiera 50 μL de la suspensión celular a cada uno de los 60 pocillos de las microplacas, pasando de la columna 2 a la 11 y de la línea B a la G.
3. Transfiera 50 μL de diluciones de referencia, muestra y control de mAb a microplacas. Siga el patrón que se muestra en la Figura 1.
4. Agregue 50 μL de la solución de inducción de apoptosis a cada pocillo.
5. Utilice controles celulares de 50 μL de células WEHI 164, dispensadas en tres pocillos. Lleve cada pocillo a un volumen final de 150 μL con un medio de cultivo de ensayo.
6. Utilice un control de citotoxicidad de una mezcla de 50 μL de células WEHI 164 más 50 μL de solución de inducción de apoptosis. Lleve cada pocillo a un volumen final de 150 μL con un medio de cultivo de ensayo.
7. Para el control de TNFα, utilice 50 μL de la solución de inducción de apoptosis y llévela a 150 μL con el medio de cultivo de ensayo.
8. Para el blanco, utilice solo 150 μL del medio de cultivo del ensayo.
9. Llene los pocillos restantes con 150 μL de medio de cultivo para evitar los efectos de evaporación de la placa.
10. Repita los pasos 4.1.1-4.1.9 dos veces en otras dos microplacas.
    nota: Las concentraciones finales de mAb en la microplaca son: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 y 0,004 μg/mL.
11. Cargue las muestras en microplacas, como se indica en la Figura 1
12. Incubar las tres placas a 37 °C y 5% de CO₂ durante 16 ± 2 h.
13. Deje reposar el reactivo de caspasa 3/7 Glo a 25 ± 5 °C durante 30 minutos antes de su uso.
14. Añada 100 μl de este reactivo a todos los pocillos, incluidas las muestras y los controles.
15. Agite las placas con un mezclador de vórtice de microplacas durante 3 minutos a 25 ± 5 °C inmediatamente después de dispensar en los pocillos.
16. Incubar las placas durante 2,5 ± 0,5 h a 25 ± 5 °C, protegidas de la luz.
17. Inserte las microplacas en el luminómetro y complete la siguiente sección.

>5. Análisis de resultados

1. Utilizando el software para la detección de luminiscencia, seleccione el modo de luminiscencia y la función de punto final.
2. Seleccione una placa de fondo transparente de 96 pocillos y sus 80 pocillos internos, excluyendo las columnas 1 y 12.
3. Seleccione un tiempo de integración de 1.250 ms y 10 s para mezclar la microplaca antes de la lectura.
4. Seleccione los pocillos donde se colocará la sustancia de referencia, la sustancia analítica y la muestra de control e identifíquelos con sus concentraciones correspondientes.
5. Lea las muestras colocadas en las microplacas con el luminómetro.
6. Utilice una cuarta ecuación de parámetro para el análisis de los resultados. Grafice una curva dosis-respuesta, como se muestra en la Figura 2.
   NOTA: En la ecuación del cuarto parámetro, C es la concentración efectiva 50 (EC50). Este valor se utilizará para comparar la sustancia de referencia, la muestra analítica y la muestra de control mediante la función efectora.
7. Para calcular las potencias relativas, fije la sustancia de referencia al 100%, calcule las potencias de la muestra y controle en consecuencia.
   nota: Esos valores se muestran en la Figura 3.

Tabla 1: Matrices de muestras de microplacas. Se debe realizar un ensayo de neutralización completo en tres microplacas dentro de las coordenadas B2 a G11. La dispensación aleatoria de muestras de referencia, analíticas y de control permite a los investigadores verificar cualquier sesgo en el ensayo.

Placa 1		Placa 2		Placa 3
pozos	muestra	pozos	muestra	pozos	muestra
B2:B11	Sustancia de referencia	B2:B11	Ejemplo de control	B2:B11	Muestra analítica
C2: C11		C2: C11		C2: C11
D2:D11	Muestra analítica	D2:D11	Sustancia de referencia	D2:D11	Ejemplo de control
E2:E11		E2:E11		E2:E11
F2: F11	Ejemplo de control	F2: F11	Muestra analítica	F2: F11	Sustancia de referencia
G2: G11		G2: G11		G2: G11

Tabla 2: Diluciones de mAb anti-TNFα. En esta tabla se muestran las diluciones seriadas de mAbs anti-TNFα. Las concentraciones finales descritas en esta tabla no son las concentraciones del ensayo, donde los mAbs anti-TNFα se diluyeron en un factor de 3 (dilución de mAb + medio de cultivo + suspensión de células). Las líneas en negrita representan las diluciones procedentes de las líneas 3, 5, 7, 9 y 10; Las líneas sin negrita representan la dilución de las líneas 3, 4 y 6. Estas diluciones seriadas se realizan justo antes de realizar el ensayo de neutralización. Se debe tener cuidado de mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces antes de dispensar las diluciones.

Columna de placa	Volumen del medio de cultivo del ensayo (μL)	Volumen de la sustancia de referencia, muestra analítica o muestra de control (uL)	Concentración en la placa de ensayo (ng/mL)
número arábigo	0	Artículo 230	Año 2000
3	150	150 desde la línea 2	1000
4	75	75 desde la línea 3	500
5	100	50 desde la línea 3	Artículo 333
6	75	75 desde la línea 4	250
7	75	75 desde la línea 5	Artículo 166
8	75	75 desde la línea 6	Artículo 125
9	75	75 de la línea 7	83
10	75	75 desde la línea 9	41
11	150	75 desde la línea 10	13

Resultados

Figura 1: Disposición de las muestras en las placas de ensayo. B1 a G11 son coordenadas de pozos en las microplacas y describen las posiciones donde se colocan las diluciones de la muestra. Las coordenadas que faltan son pozos llenos de controles y medio de cultivo de ensayo (A1-A12 y H1-H12). Esta distribución aleatoria de las muestras (diluciones directas e inversas en las microplacas) ayuda a elim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Células de fibrosarcoma de Mus musculus
RPMI-1640 Medio	ATCC	30-2001	Almacene el medio entre 2 °C y 8 °C
RPMI 1640 Medio, sin rojo fenol	GIBCO	11835-030	Almacene el medio entre 2 °C y 8 °C
Tripsina-EDTA (0,25%),rojo de fenol	GIBCO	25200-056	Almacene el medio entre -10 °C y -20 °C
DPBS, sin calcio, sin magnesio	GIBCO	Números 14190-136	Almacene el medio entre 2 °C y 8 °C
Proteína TNF-alfa humana recombinante	Sistemas de investigación y desarrollo	210-TA-020	Almacenar entre -20 °C y -70 °C
Suero fetal bovino (EE. UU.), IgG súper baja	HyClone	SH3089803	Almacenar entre -10 °C y -20 °C
Suero fetal bovino (EE.UU.), caracterizado	HyClone	SH3007103	Almacenar entre -10 °C y -20 °C
Caspasa-Glo 3/7 Kit de ensayo	Promega	G8093	Almacenar el sustrato Caspasa-Glo. 3/7 y el tampón Caspasa-Glo. 3/7 a –20 ºC protegidos de la luz
EDTA, Sal Disódica, Dihidrato, Cristal, Reactivo A.C.S.	J.T.Baker	8993-01	--
Muestra de mAb adalimumab	Probiomed	Na	Las concentraciones finales en la microplaca son: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 y 0,004 μg/mL
Referencia y control mAb adalimumab	Abbvie	Na	Las concentraciones finales en la microplaca son: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 y 0,004 μg/mL
Lector de microplacas	Dispositivos moleculares	89429-536	SpectraMax M3 Multimodo
Software del lector de microplacas	Dispositivos moleculares	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
incubadora	Revco	30482	Revco RNW3000TABB CO2 de aire forzado
Campana de flujo laminar	La empresa panadera	200256	Panadero SG603A-HE | Alta eficiencia, Clase II Tipo A2