1. Producción de MoDCs ingenuos
NOTA: Se obtuvieron muestras de sangre total de un solo ternero libre de patógenos mediante punción de la vena yugular con vacutainers heparinizados (se utilizaron ocho tubos de sangre de 9 mL para este estudio). Transporta la sangre en una caja de hielo. Almacene las muestras a 2-4 °C para su uso posterior o procéselas inmediatamente. Mantenga la sangre rotando para evitar la coagulación de la sangre. Esterilizar los vacutainers con etanol al 70%. Todos los experimentos siguientes se realizaron con una muestra biológica y seis réplicas técnicas.
- Centrifugación en gradiente de densidad para aislar PBMCs de la sangre heparinizada
- Mezcla bien la sangre invirtiéndola 10 veces.
- Con una pipeta de 10 mL, transfiera 20 mL de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 mL y dilúyalo con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Pipetea 15 mL de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 mL.
nota: Deje que el medio aislante de linfocitos alcance la temperatura ambiente antes del pipeteo.
- Incline el tubo de 50 ml que contiene el medio de aislamiento de linfocitos a una posición de 45°. Apunte la punta de una pipeta de 25 mL perpendicularmente y coloque cuidadosamente los 30 mL de PBS en sangre sobre el medio de aislamiento de linfocitos, sin mezclar los dos. Muy lentamente, vuelva a colocar el tubo de 50 ml en posición vertical.
- Centrifugar a 800 × g durante 35 min a 20 °C con aceleración máxima y sin frenado (función de deceleración desactivada).
- Utilice una pipeta Pasteur para recoger la capa de PBMC (la fina capa blanca justo después de la primera capa de plasma) y transfiérela a un nuevo tubo de 50 ml.
nota: La centrifugación en gradiente de densidad separa la sangre entera en diferentes capas. Como resultado, los eritrocitos se depositan en la parte inferior como una bolita, las células mononucleares (PBMC) se asientan en la capa de interfaz y el plasma forma la capa superior. Los granulocitos se encuentran entre el pellet y la capa de PBMC.
- Lave las PBMC cosechadas 2 veces agregando PBS hasta un volumen de 40 ml y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 minutos con la máxima aceleración y la máxima desaceleración.
- Deseche el sobrenadante por decantación, vuelva a suspender el pellet en 15 mL de 1x tampón de cloruro-amonio y potasio (ACK) e incube a temperatura ambiente durante 10-15 min.
nota: No incubar durante más de 15 minutos. El tampón ACK disponible en el mercado se utiliza para garantizar la lisis de los glóbulos rojos residuales presentes en la fracción PBMC.
- Añada PBS hasta un volumen de 40 ml y, a continuación, centrifugar a 500 × g y 4 °C durante 7 minutos con la máxima aceleración y desaceleración.
- Deseche el sobrenadante por decantación y repita el paso 1.1.9.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio de cultivo completo (a temperatura ambiente).
nota: El medio de cultivo completo está compuesto por un medio de cultivo celular RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
- Separación magnética de las células CD14+/− de la población PBMC mediante perlas magnéticas conjugadas con CD14
- Cuente las células con un contador de células de hemocitómetro limpio utilizando 10 μL de suspensión celular mezclada con 10 μL de >NOTA: El tinte azul de tripano es un químico tóxico y potencialmente cancerígeno. Debe manipularse mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto, y los desechos deben desecharse en un contenedor hermético especializado en desechos tóxicos. Las células muertas aparecerán azules, mientras que las células vivas aparecerán claras bajo el microscopio.
- Centrífuga durante 7 min a 500 × g.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en un tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) con un volumen de 40 μL por cada 1 × 107 células. Mezclar bien con una pipeta.
NOTA: El tampón FACS está compuesto por un 2% de FBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disuelto en PBS.
- Añadir 5 μL de tampón de microperlas CD14 por 1 × 107 células, y mezclar bien con una pipeta.
- Incubar durante 30 min a 4-8 °C para la selección positiva de monocitos CD14+ bovinos. Vórtice cada 15 min durante el período de incubación.
- Paso opcional (para el análisis por citometría de flujo): Añadir 10 μL de anticuerpo de tinción CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) con posterior incubación durante 15 min a 4-8 °C. Consulte el análisis de citometría de flujo en el paso 5 para obtener más detalles.
- Añadir 1 mL de tampón FACS y centrifugar durante 7 min a 500 × g.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de tampón FACS por 1 × 108 células.
- Inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador (soporte de columna magnética) y coloque un tubo de recolección de 15 mL debajo de la salida de la columna para recoger el flujo.
- Lave la columna con 1 mL de tampón FACS desgasificado. Después de enjuagar, reemplace el tubo de 15 ml usado por uno nuevo.
- Deje que la suspensión celular (del paso 1.2.8) pase a través de la columna pipeteando 1 × 108 celdas en 500 μL de tampón a la vez.
nota: Preste atención a no generar burbujas de aire mientras mezcla las celdas antes de permitirlas pasar por la columna.
- Enjuague la columna 3 veces con 3 mL de tampón FACS desgasificado cada vez.
- Recoja el flujo y etiquete esta primera fracción eluida como la fracción de células CD14− (PBMCs menos monocitos CD14+); esto también se denomina fracción de linfocitos naïve (
nota: Las células CD14− se mantienen en un medio de cultivo completo hasta que se producen MoDCs pulsadas por antígeno.
- Retire la columna del separador.
- Coloque un nuevo tubo estéril de 15 mL debajo de la columna para la recolección del efluente.
- Pipetee 5 mL de tampón FACS en la columna y empújelo inmediatamente con un émbolo.
- Recoja el flujo y etiquete esta segunda fracción eluida como la fracción de células CD14+; esto también se llama la fracción de monocitos ingenuos.
- Agregue medio de cultivo completo a los monocitos CD14+ recolectados para obtener 1 × 106 células/mL.
nota: Cuente las células vivas en la fracción de células CD14+ eluidas para estimar el volumen del medio de cultivo completo necesario para alcanzar el recuento de células deseado.
- Tome una placa estéril de 24 pocillos y agregue 1 mL de la suspensión celular (1 × 106 células/mL) a cada pocillo.
- Diferenciación de los monocitos CD14+ naïve en MoDCs naïve mediante la adición de un cóctel de citocinas al 3% p/v (GM-CSF + IL-4) con un total de 5 días de incubación
- Complemente cada pocillo que contenga monocitos CD14+ con 40 μL (3% p/v) del cóctel de citocinas suministrado en el kit.
- Incubar la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO2 y a 37 °C durante 48 h.
- El día 2, transfiera la mitad del contenido de cada pocillo (500 μL) con una pipeta a tubos individuales de 1,5 ml y centrifugue a 500 × g a 4 °C durante 7 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo completo fresco.
- Transfiera 500 μL de esta suspensión celular del paso 1.3.4 a cada pocillo designado para que el volumen final sea de 1 mL.
- Enriquezca cada pocillo con 20 μL de cóctel de citoquinas.
- Incubar el cultivo durante 72 h en una incubadora humidificada con 5% de CO2 y a 37 °C.
- Después de la incubación del día 5, retire la placa de la incubadora.
NOTA: Cada pocillo contendrá 1 mL de una suspensión celular de MoDCs ingenuos. El número de MoDCs será un porcentaje (~20%) de los monocitos originales sembrados (1 × 106/mL).
>2. Generación de MoDCs pulsados por antígeno
NOTA: Una vacuna disponible comercialmente y clínicamente aprobada contra el virus de la rabia (RV) puede inducir la diferenciación de MoDCs naïve en MoDCs maduros presentadores de antígenos. Utilice el 0,1 % (~1 μL) de una sola dosis de vacunación contra el VD para generar MoDC pulsados por antígenos. Además, es preferible producir MoDCs pulsados RV en la misma placa de cultivo que se utiliza para generar MoDCs ingenuos porque la transferencia de los MoDCs naïve a una nueva placa de 24 pocillos les afectará negativamente.
- Agregue 1 μL/mL de suspensión RV a 1 mL de cultivo de MoDC vírgenes en la placa de 24 pocillos e incube durante 48 h a 5% de CO2 y 37 °C.
NOTA: las MoDCs naïve cultivadas sin estimulación RV se utilizan como control de fondo (y como estimulación no específica para el cocultivo con linfocitos en los siguientes pasos).
- Después de la incubación, el día 7, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos.
- Agregue 1 mL de PBS helado por pocillo. Mezcle bien cada pocillo pipeteando y transfiera la suspensión a un tubo de 15 ml.
- Lave los pocillos con 2 mL de PBS helado para recoger las células residuales que quedan dentro de cada pocillo.
- Transfiera el contenido a sus respectivos tubos y centrifuga la suspensión celular a 500 × g durante 7 min.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender la pellet celular (MoDC pulsados por antígeno) en un medio de cultivo completo y ajuste el volumen a una concentración celular final de 1 × 105 células/mL.
nota: Cuente las células vivas para estimar el volumen de medio necesario para alcanzar el recuento de células deseado. Utilice MoDCs pulsados por RV a partir del día 7 para el sistema de cocultivo de linfocitos MoDC.
>3. Cocultivo de linfocitos MoDC
NOTA: El sistema de cocultivo in vitro MoDC-linfocitos determina la capacidad de los MoDC para cebar linfocitos específicos de antígeno. Los diferentes grupos de tratamiento de células después de 16 días de cocultivo incluyen específicos, inespecíficos y control. El grupo específico se define como linfocitos cocultivados con MoDCs pulsados por RV; el grupo inespecífico se define como linfocitos cocultivados con MoDC pulsados no antígenos; y el grupo control se define como linfocitos cultivados sin MoDCs.
- Añada un medio de cultivo completo a la fracción de linfocitos vírgenes eluidos (células CD14-) para alcanzar una concentración celular de 2 × 106 células/mL.
NOTA: Cuente las células vivas en el cultivo celular CD14− que se han mantenido en un medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos desde su recolección para estimar el volumen de medio requerido para lograr el recuento de células deseado.
- El día 7, tome una placa estéril de 24 pocillos y siembre los pocillos con 1 mL de suspensión de células linfocitarias vírgenes (2 × 106 células/mL) más 1 mL de suspensión de MoDC pulsada o no pulsada por antígeno (1 × 105 células/mL).
nota: El volumen total en cada pocillo será de 2 mL con una relación de 1:20 MoDCs por linfocitos por pocillo.
- Incubar la placa durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Enriquecimiento y reestimulación del cultivo con MoDCs pulsados por antígenos
- Después de la incubación del cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por antígeno, el día 9, suplementar cada pocillo con 20 ng/mL de IL-2 recombinante y continuar incubando durante otras 120 h (5 días de incubación).
- El día 14, transfiera 1 mL del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 mL y centrifugue a 500 × g durante 7 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células con 1 mL de MoDC pulsadas o no pulsadas por antígeno (1 × 105 células/mL). Mezcle suavemente mediante pipeteo y transfiera las suspensiones celulares a sus pocillos designados.
nota: En este paso, el volumen total en cada pocillo es de 2 mL.
- Continuar con incubación al 5% de CO2 y 37 °C durante 48 h. Después de la incubación en el día 16, el cocultivo está listo para el análisis mediante citometría de flujo, qPCR y ELISA.
nota: Por cada 2 mL en cada pocillo del cocultivo MoDC-linfocitos, 1 mL de células resuspendidas se tiñe para la citometría de flujo, 1 mL se utiliza para la extracción de ARN y los sobrenadantes de ambos se utilizan para ELISA.
>4. Análisis de citometría de flujo
NOTA: Tiña las células con marcadores apropiados/mAb antes de ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos (mAb de tinción y controles de isotipo), el kit, el instrumento y el software utilizados para el análisis de citometría de flujo.
- Protocolo de tinción con citómetro de flujo
nota: Realice la tinción de la superficie celular para las PBMC y los linfocitos y monocitos vírgenes utilizando mAb anti-CD14 (paso 1.2.6). Para la tinción de la superficie celular de MoDC vírgenes, utilice mAb específicos anti-CD86, anti-CD40 específicos y anti-MHC II. Para la tinción de la superficie celular de las células de los cocultivos del día 16, utilice mAbs anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD25; para la tinción intracelular, utilice mAb anti-Ki-67. Además, tiñir las células con mAb de control de isotipo negativo o sin mAb (FMO: fluorescente menos uno). La principal diferencia a la hora de teñir para marcadores de superficie e intracelulares es que para los marcadores de superficie celular, las células deben teñirse con mAb de superficie específica antes de la tinción viva/muerta (L/D) o cualquier otro proceso. Sin embargo, la tinción intracelular se realiza después de la tinción L/D y requiere un paso de fijación más permeabilización para permitir la penetración intracelular.
- Transfiera 1 mL de suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mL con una pipeta y centrifugue durante 10 min a 500 × g.
NOTA: Después de la centrifugación, cuando procese las células del cocultivo de linfocitos MoDC, guarde el sobrenadante para el análisis ELISA.
- Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS y transfiéralo a un tubo de 15 mL. Recoja las células residuales con 1 ml de PBS y combínelo con el pellet resuspendido.
- Añadir 10 mL de PBS al tubo de 15 mL que contiene las células, mezclar mediante pipeteo y centrifugar durante 7 min a 850 x g.
- Deseche el sobrenadante y repita el paso 4.1.3.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet de celda con la suspensión residual (aproximadamente 180 μL) que queda después de decantar el sobrenadante.
- Transfiera la suspensión de la celda a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pocillos para evitar derrames.
- Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, pase la placa sobre un contenedor de desechos para vaciar los pozos de líquido y golpee la placa sobre papel absorbente para garantizar la eliminación del exceso de líquido.
- Añadir 25 μL de mezcla maestra de tinción superficial por pocillo y mezclar suavemente con una pipeta, seguido de la incubación a 4 °C durante 30 min.
nota: Para preparar la mezcla maestra de tinción de superficie para un solo pocillo, agregue 2,5 μL de mAb de superficie a 20 μL de tampón FACS.
- Agregue 200 μL de tampón FACS por pocillo y centrifugue a 1.400 × g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, vacíe los pozos de líquido por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.
- Agregue 100 μL de solución de tinción L/D por pocillo. Mezclar bien con una pipeta, seguido de una incubación a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
nota: Para un solo pocillo, disuelva 0,25 μL de colorante L/D en 100 μL de tampón FACS. El tinte L/D ayuda a distinguir entre células vivas y muertas.
- Añadir 100 μL de tampón FACS. Cubra los pocillos con la tapa y centrifugue la placa durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente.
- Repita el paso 4.1.11.
- Añadir 50 μL de solución de fijación por pocillo (suministrada con el kit) y mezclar con una pipeta antes de incubar la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
- Agregue 150 μL del 1x tampón de lavado de permeabilización (PW) provisto con el kit y cubra los pocillos con la tapa.
nota: Para preparar 10 mL de tampón PW 1x, diluya 1 mL de tampón permanente 10x en 10 mL de dH2O.
- Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente.
- Añadir 200 μL de 1x PW, seguido de una centrifugación a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente.
- Para la tinción intracelular, agregue 25 μL de mezcla maestra de tinción intracelular (Ki-67 mAb antihumano) por pocillo. Mezclar bien e incubar la placa durante 30 min a 4 °C o en hielo en la oscuridad.
nota: Para preparar la mezcla maestra de tinción intracelular para un solo pocillo, agregue 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. El marcador de tinción intracelular se utiliza solo cuando se procesan células del cocultivo del día 16. La tinción intracelular no se realiza mientras se procesan PBMC, linfocitos vírgenes, monocitos y MoDC vírgenes.
- Después de la incubación, agregue 200 μL de 1x PW a cada pocillo. Mezclar con una pipeta y centrifugar durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente.
- Añadir 200 μL de tampón FACS, seguido de una centrifugación a 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa sobre papel absorbente.
- Vuelva a suspender el pellet de la célula en 200 μL de tampón FACS y transfiera el contenido de cada pocillo a tubos de citómetro de flujo estériles separados. Utilice 300 μL de tampón FACS por pocillo para recoger las células residuales. Las células ya están listas para el análisis por citometría de flujo.
- Ejecución de la muestra en un citómetro de flujo
nota: Las muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo (utilizando láseres de 488 nm, 638 nm y 405 nm) de acuerdo con el manual del fabricante. Consulte el manual para obtener más información, solucionar problemas y personalizar el protocolo.
- Realice los procedimientos de limpieza de rutina antes y después de leer las muestras.
nota: No salte una posición mientras carga los tubos en el instrumento.
- Para el ciclo de limpieza, utilice un total de cuatro tubos, con el primer tubo que contenga reactivo de limpieza de flujo y los tres tubos restantes que contengan dH2O; cada tubo tendrá 3 mL. Durante el proceso de limpieza, adquiera datos con un caudal medio durante aproximadamente 1 minuto capturando 100.000 eventos por tubo por debajo de 330 V para dispersión directa (FSC) frente a 265 V para dispersión lateral (SSC).
nota: No se deben reportar escombros o eventos celulares durante la limpieza; Si esto sucede, vuelva a realizar el paso de limpieza. Para ejecutar las muestras, asegúrese de que todas las muestras estén en una suspensión homogénea antes de adquirir los datos, ya que esto garantiza una lectura precisa.
- Para conectar y encender el citómetro, haga clic en el botón Aplicación ubicado en la esquina izquierda de la barra de título. En el menú desplegable de la aplicación, seleccione la opción Citometría y haga clic en la opción Power On.
nota: En el menú desplegable de la aplicación, la opción Abrir permite a los usuarios navegar a través de los ensayos preprogramados, mientras que la opción Nuevo protocolo permite a los usuarios crear nuevos protocolos.
- Cargue inicialmente la muestra de control negativo en el soporte multitubo. Seleccione Nuevo protocolo y observe la lista de trabajo en el lado izquierdo del espacio de trabajo/pantalla.
- En el pool de trabajo, defina la posición de la muestra en el soporte multitubo y asigne un nombre a la muestra y un protocolo para su identificación.
- Desde el panel de hardware ubicado en el lado izquierdo del espacio de trabajo, ajuste y seleccione múltiples parámetros, como los detectores (FSC, SSC y 10 rangos de fluorescencia), los voltajes (V) y las ganancias de los fotomultiplicadores, y el área-altura-ancho (AHW) de la señal><.
nota: Se seleccionaron los siguientes ajustes para los detectores en función del experimento y el instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- Desde el Panel de control de adquisición de instrumentos ubicado debajo de la barra de título, ajuste las opciones de caudal (medio), Tiempo (5 min) y Eventos (consulte el paso 5.2.8) que desea detectar. Haga clic en la opción Adquirir Single para permitir que el instrumento dibuje/ejecute la muestra y muestre la vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
- A partir de la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia (voltaje y ganancia) y el tamaño de la celda para dibujar eventualmente puertas alrededor de la población de celdas deseada mientras excluye cualquier residuo celular.
nota: FSC ayuda a distinguir las células en función del tamaño, lo que permite a los usuarios diferenciar entre células del sistema inmunitario, como los monocitos y los linfocitos; Los monocitos son más grandes y muestran una mayor intensidad de FSC en comparación con los linfocitos.
- Adquiera aproximadamente un total de 5.000 MoDC vivos, 50.000 linfocitos vivos y 50.000 eventos de monocitos vivos.
- Una vez que todos los parámetros estén ajustados en referencia a la muestra de control negativa, haga clic en Detener y guarde el protocolo.
- Ahora cargue todas las muestras en el cargador multitubo. Defina cada muestra en el pool de trabajo y aplique los parámetros ajustados en referencia al control negativo a todas las muestras del experimento. Haga clic en la opción Adquirir para permitir que todas las muestras del experimento se ejecuten consecutivamente.
- Una vez adquiridos los datos de todas las muestras, guardarlos y transformarlos en datos legibles mediante un software de análisis de datos adecuado que permita la generación de histogramas secuenciales biparamétricos y monoparamétricos.
