Ensayo de alteración de hemocitos para evaluar la readhesión de hemocitos a las bolsas hematopoyéticas

Resumen

Fuente: Petraki, S. et al., Ensayo de las poblaciones de células sanguíneas de la larva de Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

Este video muestra el ensayo de perturbación de hemocitos, evaluando la readhesión de hemocitos en las bolsas hematopoyéticas de las larvas de Drosophila. La alteración mecánica libera hemocitos residentes, elevando los recuentos de hemocitos circulantes. Después de la recuperación, se confirma la readherencia de los hemocitos residentes, lo que ilustra la reversibilidad.

Protocolo

>1. Ensayo de sangrado/raspado de hemocitos

1. Preparación de diapositivas:
   1. Opción 1 para microscopios sin función de escaneo de mosaicos: Para cada larva a analizar, prepare un portaobjetos de vidrio con aproximadamente 5 pocillos de Papanicolaou de cuadrados de 2 mm cada uno, correspondientes al área de visión de campo del microscopio; agregue aproximadamente 5 a 10 μl de medio S2 a cada uno (Figura 1A). Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen.
   2. Opción 2 para microscopios con función de escaneo de baldosas: Para cada larva a analizar, prepare un portaobjetos de vidrio con 3 a 4 pocillos de Papanicolaou de ~3 a 4 mm cuadrados cada uno; agregue aproximadamente 15 a 20 μl de medio S2 a cada pocillo (Figura 1B). Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen.
      nota: El número de pocillos recomendado anteriormente es suficiente para un total de hasta 3.000 hemocitos por larva (larvas de^2º estadio tardío, ~2,5 - 3 mm de longitud, transgén que marca la mayoría de las células sanguíneas de las larvas). Al evaluar un mayor número de células sanguíneas, es posible que se necesiten más pocillos para evitar el hacinamiento.
2. Colección de larvas:
   1. Rocíe agua en un frasco de moscas que contenga larvas y enjuague las larvas en una placa de Petri, o coloque un poco de comida que contenga larvas en una placa de Petri y diluya con agua usando una botella de agua.
   2. Recoja suavemente las larvas de la placa de Petri con un pincel y colóquelas en agua en una placa de cavidad o en un portaobjetos sobre un bloque frío.
      nota: Las larvas se pueden mantener durante un tiempo limitado en agua o en un bloque frío; Utilice las muestras dentro de los 45 minutos o menos para evitar la muerte de las larvas o efectos no deseados en los hemocitos.
3. disección:
   1. Seleccione las larvas bajo un microscopio de fluorescencia en un bloque de metal frío. Mida los tamaños e identifique las larvas si lo desea.
   2. Aislamiento de hemocitos circulantes ("Bleed"):
      1. Una vez seleccionadas las larvas, coloque una larva en el primer pocillo del corral (Figura 1C, 2A).
      2. Use 2 agujas limpias o tijeras y pinzas de disección para hacer una incisión en los extremos posterior y anterior de la larva. Para evitar perturbar a los hemocitos residentes, lo mejor es hacer estas incisiones en el lado ventral de la larva. Para obtener resultados consistentes, haga las incisiones en los mismos lugares para cada larva. Para las larvas del^1er estadio, 1 incisión (en la ventral anterior) es suficiente.
      3. Deje que la larva sangre durante unos segundos sin ninguna presión o agitación física (Figura 2A).
         nota: Si se trabaja con varias larvas, es mejor hacer estas incisiones para cada una antes de continuar con el siguiente paso para evitar mantener las larvas en el hielo durante demasiado tiempo, lo que podría afectar la integridad de las muestras.
      4. Levante suavemente la larva con las agujas o pinzas y sumérjala en el segundo pocillo para enjuagar los hemocitos circulantes restantes. Después de eso, sigue con la liberación de hemocitos residentes.
   3. Aislamiento de hemocitos residentes ("Scrape"):
      1. Transfiera suavemente la larva al siguiente pocillo (Figura 2C).
      2. Identifique la glándula linfática de la larva, que generalmente se encuentra aproximadamente a 1/3 del extremo anterior de la larva, y que puede emitir fluorescencia dorsalmente a través de la pared del cuerpo de la larva. Evite la glándula linfática mientras libera los hemocitos residentes sujetando la larva con una aguja lo más cerca posible de la glándula linfática para evitar la perforación (Figura 2C).
         nota: Durante el desarrollo normal, la maduración de los hemocitos de las glándulas linfáticas se retrasa en comparación con los hemocitos larvales, y los reporteros fluorescentes de los hemocitos diferenciados pueden no mostrar una señal en los ganglios linfáticos de las larvas jóvenes. En estos casos, se debe prestar menos atención a la glándula linfática, ya que no se espera contaminación de hemocitos larvarios diferenciados marcados con fluorescencia por hemocitos de glándula linfática.
      3. Liberan células sanguíneas residentes en un proceso de disección de raspado y/o pinchazo. Use una punta de aguja para sujetar eficazmente la larva cerca de la glándula linfática (ver arriba) u otras áreas del cuerpo según sea necesario. Use otra aguja para pinchar los grupos de hemocitos que son visibles a través de la pared del cuerpo de la larva (Figura 2C, E), con el objetivo de separar los hemocitos. Los hemocitos también se pueden liberar con un movimiento de raspado. Sin embargo, el desgarro temprano de la epidermis puede liberar grandes grupos de células sanguíneas, lo que podría dificultar el recuento automatizado><. nota: Dependiendo de la edad y el genotipo de la larva, el número de hemocitos totales variará. Distribuya el proceso de liberación descrito anteriormente en varios pocillos para evitar el hacinamiento de algunos pocillos con células sanguíneas, lo que podría dificultar el análisis de imágenes de una sola célula.
      4. Si quedan pocos hemocitos en la canal final, cuente estos hemocitos mediante la observación a través del microscopio y el uso de un contador de conteo manual (Figura 2E). Para facilitar el recuento, coloque la carcasa en un área limpia del mismo portaobjetos y extiéndala lo más finamente posible para reducir el número de planos ópticos.
      5. Una vez completada la disección, espere entre 5 y 10 minutos para que las células se asienten (pero no necesariamente se adhieran) antes de obtener imágenes de los pocillos. Incubar el portaobjetos en una cámara húmeda para evitar que se seque y evitar la manipulación brusca de los portaobjetos, que podrían perturbar los hemocitos sedimentados><. nota: Al determinar los recuentos de hemocitos, las células liberadas no se fijan y las células deben ser visualizadas poco después de la disección, preferiblemente dentro de los 30 minutos posteriores a la liberación de la larva. Dependiendo del volumen del medio y las propiedades de la celda, la gran mayoría de las células se habrán asentado en 5 a 10 minutos, lo que debe confirmarse enfocándose a través de los planos ópticos del medio en el pocillo. Sin embargo, solo una fracción de las células sanguíneas se habrán adherido a la superficie del portaobjetos en este momento, un hecho que debe tenerse en cuenta si se modifica este protocolo para enfoques basados en la fijación celular.
4. cuantificación:
   1. Tome imágenes de los hemocitos asentados bajo un microscopio fluorescente (Figura 2B, D, F). A continuación, con la cuantificación de hemocitos mediante el software ImageJ.
   2. Prepare la imagen para el algoritmo de recuento de células ImageJ:
      1. Abra la imagen del pozo usando ImageJ: Archivo → Abrir → (localice el archivo y seleccione).
      2. Asegúrese de que las imágenes sean de 8 bits o 16 bits. Ajuste el umbral de la imagen seleccionando Imagen, luego haga clic en Ajustar y seleccione Umbral. Observe la "Ventana de umbral" (Figura 3A).
      3. Marque la opción "Fondo oscuro". Seleccione "Rojo" y aumente el nivel de umbral inferior (vea la flecha negra) hasta que cada celda de la imagen esté marcada con un punto rojo (las celdas que no se están cubriendo se verán en escala de grises; Figura 3B). A medida que aumenta el umbral inferior, algunas celdas se desmarcarán. Este puede ser el indicador de hasta qué punto establecer el umbral inferior.
         nota: Ocasionalmente, los grupos de células no se pueden resolver y el contador de partículas los contaría como uno solo. En tales casos, el número de celdas en un grupo se puede estimar examinando la imagen (ampliando si es necesario) y contando manualmente usando un contador de recuentos. Alternativamente, el umbral inferior se puede aumentar para resolver grupos de celdas; Las celdas no marcadas que resulten de esta manipulación se pueden contar utilizando un contador de recuento.
   3. Analice el número de celda con ImageJ:
      1. Inicie el analizador de partículas para contar las celdas (Figura 3C). Seleccione Analizar y haga clic en Analizar partícula. Opcionalmente, seleccione "Superponer contornos" para ver las partículas que cuenta el algoritmo (Figura 3D). Alternativamente, establezca un límite para el tamaño o el área de píxeles de una unidad (por ejemplo, celda, grupo de celdas, etc.) para que el algoritmo cuente.
      2. Haga clic en Aceptar. Observe una ventana de resumen con el conteo (Figura 3E).

>2. Ensayo de alteración de hemocitos

1. Para perturbar los hemocitos, seleccione las larvas y colóquelas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con aproximadamente 0,5 g de perlas de vidrio (212 - 600 μm) y agregue 0,5 ml de agua.
2. Agite el tubo, a mano, a velocidad 10 durante 1 min.
3. Recupera las larvas de las cuentas de vidrio derramando el contenido del tubo de microcentrífuga en una placa de Petri y seleccionando las larvas con un pincel.
4. Para la fase de recuperación, coloque las larvas en placas de Petri previamente preparadas con pequeñas cantidades de alimento para moscas. Permita que las larvas restablezcan su patrón de hemocitos durante un período de 45 minutos o según lo desee.
   nota: Deseche cualquier larva que haya dejado de moverse, ya que han muerto en el proceso. Sin embargo, normalmente vemos poco daño después de 1 minuto de vórtice.
5. Después del período de recuperación, continúe con el ensayo de sangrado/raspado como se describe anteriormente en la Sección 1.

Resultados

Figura 1. Configuración y esquema del ensayo de sangrado/raspado y perturbación de hemocitos. (A)Configuración de portaobjetos de una sola imagen: cinco cuadrados de 2 mm para obtener imágenes con un objetivo 5X. (B) Configuración de portaobjetos de escaneo de baldosas: cuatro cuadrados de 3 mm para obtener imágenes de sangrados/raspados de larvas de ≤2,5 mm con un microscopio de esc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri de 6 cm/9 cm			Uno por cada genotipo a evaluar
Botella rociadora de agua
Cuchara/espátula de metal
Pincel fino			por ejemplo, un "liner"
Plato con cavidad de vidrio
Bolígrafo PAP: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Portaobjetos de vidrio			Cada diapositiva tendrá 5 o más cuadrados de PAP PEN dibujados en ellas. El tamaño de los cuadrados depende del objetivo de la imagen y del aumento de la cámara del microscopio; por ejemplo, cuadrados de 2 mm.
Cámara húmeda			Esto se usará para evitar que los portaobjetos y los pozos se sequen: recipiente sellado con toallas de papel húmedas que recubren los lados/fondo
Medios de cultivo celular de Drosophila de Schneider	Invitrogen
Bloque frío			Se trata de un bloque de metal (también conocido como bloque calefactor) enfriado en un cubo que contiene hielo; preferiblemente de color negro u otro color oscuro no reflectante
Dos jeringas de 1 ml con agujas (27G 1/2)	Becton Dickinson		Para disecciones.
Opcional: Tijeras de muelle quirúrgico (filo de 2 mm)	Herramientas de Bellas Ciencias
Perlas de vidrio, 212-600 micras	sigma
Tubos Eppendorf de 2 ml	Eppendorf		Uno por genotipo evaluando
Mezclador de vórtice	Fisher Científico
Larvas transgénicas de Drosophila con hemocitos marcados con fluorescencia. Los transgenes adecuados incluyen: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP y -GFP (Gajewski et al., 2007), o HmlΔ-GAL4 (Sinenko y Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (por H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), o eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combinado con UAS-GFP u otros transgenes de proteínas fluorescentes.
Microscopio de disección de fluorescencia	Leica		Aquí: Leica M205, opcional con cámara, software de imagen y módulo de medición
Microscopio de fluorescencia invertida con accesorio de cámara	Leica o Keyence		Con o sin función de escaneo de mosaicos (p. ej. Serie Leica DMI, serie Keyence BIOREVO BZ-9000)