Una técnica de tinción de tetrámero de péptido-MHC-I para analizar células T de memoria CD8+ específicas de SIV

Resumen

Fuente: Gonzalez-Nieto, L., et al. Análisis de células T CD8⁺ específicas del virus de la inmunodeficiencia de simios en macacos Rhesus mediante tinción de tetrámero con péptido-MHC-I. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra un método para caracterizar las células T de memoria CD8⁺ específicas para el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS) utilizando tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor de clase I (PMHC-I). Un tetrámero pMHC-I es un complejo de cuatro moléculas MHC-I unidas a péptidos específicos de SIV y conjugadas a un fluoróforo. Estos tetrámeros se unen selectivamente a los receptores de células T (TCR) en las células T CD8⁺ específicas del VIS, lo que facilita la caracterización de estas células.

Protocolo

1. Tratamiento PKI

NOTA: Esto es opcional, pero recomendado para los tetrámeros Mamu-B*017:01.

1. Vuelva a suspender PBMC en medio R10 a una concentración de 1,6 x 10⁷ células/ml.
2. Añadir 50 μl de esta suspensión celular a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Añadir 50 μl de una solución de PKI de 100 nM a cada tubo.
3. Vórtice de cada tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min. Al final de este paso, cada tubo debe tener 100 μl de una suspensión celular que contenga 8,0 x 10⁵ PBMC y 50 nM de PKI.
4. Continúe con el paso de tinción de tetrámero pMHC-I.

>2. Tinción con tetrámeros pMHC-I marcados con fluorocromo

1. Antes de preparar la mezcla maestra de tetrámero pMHC-I, centrifugar los tubos de tetrámero pMHC-I a 20.000 x g durante al menos 15 min a 4 °C. El objetivo de este paso es granular agregados de proteínas en la solución de tetrámero pMHC-I que pueden aumentar la tinción de fondo. Una vez realizado el paso de centrifugación, evite pipetear desde el fondo del tubo donde se habrán acumulado los agregados de proteínas.
2. Prepare suficiente mezcla maestra de tetrámeros pMHC-I para teñir todos los tubos experimentales. Prepare un exceso del 15% del volumen total de esta mezcla maestra para tener en cuenta los errores de pipeteo.
3. Diluya los tetrámeros de pMHC-I en un tampón de tinción (por ejemplo, tampón de tinción brillante) de modo que se añadan 25 μl de la mezcla maestra de tetrámeros de pMHC-I a cada prueba.
   1. Marque PBMC con dos tetrámeros pMHC-I por prueba; uno conjugado con aloficocianina (APC) y el otro con violeta brillante (BV) 421.
4. Añadir 8,0 x 10⁵ PBMC a los tubos de citometría de flujo correspondientes en un volumen final de 100 μl. Si las células se sometieron al tratamiento PKI descrito anteriormente, ya deberían resuspenderse en 100 μl en este paso.
5. Añadir 25 μl de mezcla maestra de tetrámero pMHC-I a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Al final de este paso, el volumen final de cada tubo debe ser de 125 μl.
6. Vórtice cada tubo con el fin de homogeneizar la suspensión celular.
7. Incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min. Prepare el cóctel de anticuerpos monoclonales (mAb) que tiñe la superficie durante esta incubación de 45 minutos.

>3. Tinción superficial

1. Prepare suficiente mezcla maestra de mAb para teñir todos los tubos experimentales. Prepare un exceso del 15% del volumen total de esta mezcla maestra para tener en cuenta los errores de pipeteo.
2. Ajuste el volumen de la mezcla maestra con tampón de tinción para que se agreguen 50 μl por prueba.
3. Para la exclusión adecuada de las células T no CD8⁺ y la delineación de los subconjuntos de memoria, utilice cantidades tituladas de mAbs dirigidas contra las siguientes moléculas en la mezcla maestra de tinción de superficies
   nota: Los fluorocromos conjugados a cada mAbs se proporcionan como referencia: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 y CCR7 FITC. Tenga en cuenta que los mAbs contra CD14, CD16 y CD20 se conjugan con el mismo fluorocromo (es decir, BV 510) ya que se incluirán en la compuerta de "descarga".
4. Incluya un tinte fijable para discriminar las células muertas en la mezcla maestra de tinción superficial [es decir, colorante reactivo a la amina (ARD)]. Asegúrese de que el reactivo ARD esté conjugado con un fluorocromo con un espectro de emisión similar a los utilizados en la compuerta de "descarga". En este caso, utilice ARD Aqua.
5. Añadir 50 μl de la mezcla maestra de tinción descrita en 3.1-3.4 a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Al final de este paso, el volumen final de cada tubo debe ser de 175 μl.
6. Vórtice de cada tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 25 min.
7. Células de lavado con tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina y 0,45 g/L de NaN3).
   cautela: La azida sódica (NaN₃) es una sustancia tóxica. La exposición incluso a cantidades mínimas puede causar síntomas. Manipule esta sustancia de acuerdo con las pautas especificadas por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental (EHS) de la institución donde se realizan estos experimentos.
8. Centrifugar los tubos a 510 x g durante 5 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante en un contenedor de residuos separado. Asegúrese de no alterar el pellet.
   cautela: No decante el sobrenadante del tampón de lavado en depósitos que contengan lejía, ya que puede reaccionar con la azida de sodio presente en el tampón de lavado y provocar la formación de un gas tóxico. Póngase en contacto con la Oficina de EHS de la institución donde se están realizando estos experimentos para obtener pautas sobre cómo desechar la azida de sodio.
9. Después de la decantación, vórtice las células en el líquido sobrante retenido en cada tubo.

>4. Fijación celular

1. Agregue 250 μl de una solución de paraformaldehído (PFA) al 2% a todos los tubos para fijar las células.
   PRECAUCIÓN: El PFA es una sustancia tóxica. La exposición incluso a cantidades mínimas puede causar síntomas. Manipule esta sustancia de acuerdo con las pautas especificadas por la Oficina de EHS de la institución donde se realizan estos experimentos.
   1. Dado que la solución de PFA al 2% debe ser isotónica para las células, use PBS para preparar esta solución. Cien mililitros de una solución de PFA al 2% son suficientes para múltiples experimentos. Agite completamente todos los tubos inmediatamente después de la adición de PFA al 2% para evitar la formación de agregados celulares.
2. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 20 min.
3. Lave las células repitiendo los pasos 3.7-3.9. Una vez completado este paso, las células se pueden almacenar en la oscuridad a 4 °C durante 24-48 horas. Antes de proceder a la fase de permeabilización, vórtice los tubos a fondo.

>5. Permeabilización de las células

1. Añadir 500 μl de tampón de permeabilización. Vórtice de todos los tubos.
2. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Lave las células repitiendo los pasos 3.7-3.9.

>6. Tinción intracelular

1. Prepare suficiente mezcla maestra de mAb para teñir todos los tubos experimentales.
2. Ajuste el volumen con PBS o tampón de tinción para que se añadan 50 μl de la mezcla maestra de mAb intracelular por prueba.
3. Prepare la mezcla maestra de mAb descrita en los puntos 6.1 y 6.2 utilizando cantidades tituladas de mAbs dirigidas contra CD3 y granzima B (Gzm B).
   nota: La interacción del TCR por parte de los tetrámeros pMHC-I puede dar lugar a la internalización de CD3, lo que puede interferir con la detección de tetrámeros + linfocitos T CD3⁺ CD8⁺ si se añade el mAb anti-CD3 a la mezcla maestra de tinción superficial. Para evitar esto, agregue el mAb anti-CD3 en esta etapa, es decir, después de que las células se permean. Los fluorocromos conjugados a cada mAb se enumeran como referencia: CD3 PerCP Cy5.5 y Gzm B PE.
4. Añadir 50 μl de cóctel de mAb a los tubos correspondientes. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
5. Lave las células repitiendo los pasos 3.7-3.9. Los tubos están listos para ser adquiridos en un citómetro de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dasatinib	Axon medchem	Axón 1392	Debe resuspenderse en DMSO y almacenarse inmediatamente a -20 °C
RPMI con Glutamax	gibco/ Tecnologías de Vida	61870-036	Debe almacenarse a 4 °C
FBS inactivado por calor	gibco/ Tecnologías de Vida	10082-147	Debe almacenarse a 4 °C
Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B	Lonza	17-745E	Debe almacenarse a 4 °C
DMSO, anhidro	Tecnologías de la Vida	D12345	Almacene a temperatura ambiente.
Tubos de polipropileno de fondo redondo de 5 ml	VWR	60819-728
Tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromo	Núcleo de tetrámero de los NIH o MBL, Inc.		Debe almacenarse y mantenerse a 4 °C. Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min antes de su uso. No congelar.
AcM conjugados con fluorocromo	Varias empresas		Debe almacenarse y mantenerse a 4 °C. No congelar.
LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas Aqua reparable	Tecnologías de la Vida	l34957	Debe almacenarse a -20 °C. Vuelva a suspender cada alícuota en 50 μL de DMSO antes de su uso.
Tampón de manchas brillante	BD Biociencias	563794	Debe almacenarse a 4 °C
Solución salina tamponada con fosfato	VWR	97064-158	Almacenar a temperatura ambiente
Albúmina Bovina	VWR	700011-230	Debe almacenarse a 4 °C
Azida de sodio	VWR	97064-646	Almacene a temperatura ambiente. Sustancia tóxica. No mezclar con lejía.
blanquear	VWR	89501-620	Químico corrosivo, no se puede mezclar con azida de sodio. Manéjelo con cuidado
Paraformaldehido	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15714-S	Reactivo inflamable, corrosivo y tóxico. Manéjelo con cuidado
Polisorbato 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Almacenar a temperatura ambiente
Solución de permeabilización 2	BD Biociencias	340973	Reactivo tóxico y corrosivo. Manéjelo con cuidado
Tubos Sarsdet 1.5mL con tapa de rosca	VWR	72.692.005
Tubos de baja unión de ADN/ARN de 2,0 ml	Eppendorf	22431048	Se prefiere el uso de microtubos estériles
Mezclador de vórtice
Gabinete de bioseguridad
Sistema de purificación de agua Milli Q Intergral	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Se puede utilizar agua de grado de biología molecular de cualquier proveedor
Microcentrífuga
centrífuga
Refrigerador a 4 °C
BD LSR II	BD Biociencias		El citómetro de flujo debe contener láseres y filtros que sean compatibles con el panel de tinción utilizado.
Agua desionizada
papel de aluminio	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
incubadora			Debe ser capaz de mantener una temperatura interna de 37 °C
Software FACS Diva	BD Biociencias
Software Flowjo versión 9.6	Flowjo		Se utiliza para analizar archivos FCS generados por el software FACS Diva
Puntas de micropipetas