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>1. Marcaje fluorescente y perfusión de leucocitos (PMN o THP-1 para humanos y RAW264.7 o monocitos primarios de ratón para ensayos basados en flujo murino)
- Etiquetado fluorescente
- Marque los leucocitos (1 x 106/mL) con la tinción de ácido nucleico fluorescente verde permeable a la célula (1 μM). Incubar las células durante 30 min a 37 °C.
- Lavar las células con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 min, y suspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL (5 mL por condición de prueba, dependiendo del caudal) en tampón de ensayo.
- Preparación del ensayo en cámara de flujo
- Para la adhesión de leucocitos en una monocapa celular, deseche el medio de cultivo celular de la placa y ensamble en la cámara de flujo. Conecte el tubo a la jeringa. Para la adhesión de leucocitos en las plaquetas inmovilizadas, conecte el microportaobjetos a la jeringa. Precalentar un baño de agua a 37 °C.
- Tome una jeringa de perfusión (50 ml), instale la jeringa en el soporte de la jeringa y ponga la bomba en modo de extracción. Ajuste el volumen de la bomba a 0 ml y el diámetro a 26,70 mm para la jeringa de 50 ml.
- Conecte un conector luer de codo a un extremo del tubo. Coloque un acoplador de bloqueo luer en la jeringa y conecte el tubo con el conector luer de codo al acoplador de bloqueo luer. Conecte el extremo del tubo libre a la cámara de flujo.
- Perfusión y adherencia leucocitaria
- Para la adhesión de leucocitos en una monocapa celular, deseche el medio de cultivo celular de la placa y ensamble en la cámara de flujo. Conecte el tubo a la jeringa. Para la adhesión de leucocitos en las plaquetas inmovilizadas, conecte el microportaobjetos a la jeringa.
- Para la perfusión y adhesión de leucocitos sobre una monocapa vascular o plaquetaria, coloque el segundo tubo en un tubo cónico de 50 ml que contenga tampón de ensayo y llene el tubo con una pipeta de 1 mL, luego exprima el tubo y conéctelo a una cámara de flujo.
- Antes de la perfusión leucocitaria, añadir 3 mM de CaCl2 y 2 mM de MgCl2 a la suspensión celular e incubar durante 5 min a 37 °C.
- Perfundir tampón de ensayo antes de la perfusión de las células para eliminar el posible aire de la cámara y los tubos.
- Cierre los extremos de los tubos apretándolos firmemente y cambiando el tubo del tampón de ensayo a la suspensión de la celda, evitando que las burbujas de aire queden atrapadas. Perfundir celdas con un caudal/esfuerzo cortante adecuado hasta que lleguen las primeras celdas.
- Perfunda celdas con un caudal/esfuerzo cortante adecuado durante 2 min, y capture al menos 6 imágenes entre 2 y 6 min de celdas rodantes y adherentes con un microscopio de contraste/fluorescencia de fase invertida (p. ej., EVOS-FL) utilizando un aumento de 100X conectado a una cámara digital CCD o CMOS><.
NOTA: El caudal/esfuerzo cortante depende de las dimensiones de la cámara de flujo y la viscosidad del perfusado. Para la cámara de perfusión utilizada aquí (ver Tabla de Materiales):
τ=η*97.1*Φ
τ: esfuerzo cortante (1 dyn/cm2)
η: viscosidad (0,015 dyn*s/cm2)
Φ: Caudal (0,67 mL/min)
- Deadhesión de leucocitos
- Para la desadherencia, cambie el tubo de suspensión celular a tampón de ensayo apretando el tubo, evitando que las burbujas de aire queden atrapadas.
- Separe las células por perfusión con tampón de ensayo con un caudal/esfuerzo cortante adecuado (véase la nota 3.3.7).
- Transmigración de leucocitos
- Para la transmigración de leucocitos, perfunda los leucocitos (paso 3) hasta que se adhiera una cantidad adecuada de leucocitos (~50 células/campo de visión).
- Reemplace la suspensión de leucocitos con tampón de ensayo.
- Registre las células transmigratorias mediante un lapso de tiempo cada 10-15 s durante 30-60 minutos a 37 °C.