Ensayo basado en flujo laminar para estudiar las interacciones entre los leucocitos y las células endoteliales

Resumen

Fuente: Vajen, T., et al. Ensayos basados en flujo laminar para investigar el reclutamiento de leucocitos en células vasculares cultivadas y plaquetas adherentes. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un ensayo basado en flujo laminar para caracterizar la interacción de leucocitos y socios celulares como las células endoteliales. Este método proporciona información dinámica sobre la adhesión, la muerte y la transmigración de los leucocitos cuando se perfunden sobre una capa intacta y confluente de células vasculares.

Protocolo

>1. Marcaje fluorescente y perfusión de leucocitos (PMN o THP-1 para humanos y RAW264.7 o monocitos primarios de ratón para ensayos basados en flujo murino)

1. Etiquetado fluorescente
   1. Marque los leucocitos (1 x 10⁶/mL) con la tinción de ácido nucleico fluorescente verde permeable a la célula (1 μM). Incubar las células durante 30 min a 37 °C.
   2. Lavar las células con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 min, y suspender las células a una concentración de 0,5 x 10⁶ células/mL (5 mL por condición de prueba, dependiendo del caudal) en tampón de ensayo.
2. Preparación del ensayo ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio de fluorescencia invertida, p. ej., EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Bomba p. ej. modelo: 210-CE	Instrumentos de precisión mundial	78-9210W
Placa de cultivo celular Falcon de 35 mm con tratamiento TC estilo EasyGrip	Corning	353001
Jeringa de 50 ml	Becton Dickinson	300137
Tubo de silicona	VWR	228-0700
Conector Luer de Codo Macho	Ibidi	10802
Acoplador de bloqueo Luer hembra	Ibidi	Año 10823
Cámara de flujo	Hospital Universitario RWTH Aquisgrán	Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitroUntersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. Año 2005.
Colágeno tipo I, cola de rata	Life Technologies Europe bv	A1048301
TNF-α humano recombinante	Peprotech	300-01A
Activador del receptor de trombina para el péptido 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
Tinción de ácido nucleico fluorescente verde SYTO 13	Life Technologies Europe bv	S7575
Cloruro de calcio dihidratado	Merck	102382
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Monocito/macrófago de ratón RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto contenido de glucosa	Gibco	11965092