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1. Fabricación de nanoestructuras
- Elija cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro con un espesor aproximado de 170 μm (n.º 1,5) como sustratos para la nanofabricación.
- Sumerja los cubreobjetos en una solución de piraña (proporción 3:1 de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) durante al menos 6 horas. Lave el cubreobjetos empapado en pirañas con abundantes cantidades de agua destilada desionizada (DDW) ultrapura de 18,2 MΩ.
cautela: El ácido piraña reacciona violentamente con los materiales orgánicos y debe manipularse con extremo cuidado.
- Deposite una película delgada de cromo de 10 nm en los cubreobjetos por evaporación del haz de electrones para evitar efectos de carga durante el modelado y la obtención de imágenes de nanoestructuras.
- Centrifugar la primera capa de copolímero de metacrilato de metilo (MMA_EL6) de lactato de etilo a 2.000 rpm durante 45 segundos y hornear a 150 °C. Girar la segunda capa de polimetacrilato de metilo (950PMMA_A2) a 3.000 rpm durante 45 segundos y hornear a 180 °C.
- Modele la resistencia de la bicapa utilizando la litografía por haz de electrones (EBL) a 25 kV con una dosis de área de 300 μC/cm2. Desarrollar en alcohol isopropílico (IPA)/metil isobutilcetona (MIBK): 2/1 y enjuagar en IPA.
- Deposite la película de Ti (5 nm) / Au (80 nm) sobre el sustrato mediante un evaporador de haz de electrones.
- Después de la deposición de oro, levante la resistencia de la bicapa de copolímero remojando el sustrato en acetona durante 4 horas.
- Inspeccione el sustrato con el microscopio electrónico de barrido (SEM) para confirmar la forma y el tamaño de la nanoestructura, elimine el cromo restante del sustrato mediante grabado húmedo con grabador CR-7 durante 60 segundos en RT y luego enjuague en DDW.
- Diseñe un espaciado de centro a centro de 33 μm para dejar espacio para la obtención de imágenes celulares entre matrices. Modele las nanoestructuras en un patrón de 20 x 20 para cada matriz con un paso de 300 nm utilizando un escritor de haz de electrones. Cada chip contiene 300 matrices con una dimensión de nanoestructura típica de 80±2,5 nm de altura y 70±2,5 nm de diámetro.
- Inspeccione un subconjunto de matrices utilizando el microscopio de fuerza atómica (AFM) para verificar el tamaño y la uniformidad.
- Coloque un anillo de soporte, generalmente de silicona, en la parte posterior del cubreobjetos con un epoxi de curado UV.
>2. Limpieza de virutas y aplicación de monocapa autoensamblada
- Para la limpieza y regeneración de los chips, cenizas de plasma a una potencia de 40 W en una mezcla de 300 mTorr de 5% de hidrógeno y 95% de argón durante 45 segundos después de limpiar la cámara durante 5 minutos en las mismas condiciones.
- Funcionalizar las nanoestructuras de oro inmediatamente después de la incineración por plasma sumergiendo el chip en una solución de tiol etanólico de dos componentes que consta de una proporción 3:1 de SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) y un componente con un grupo funcional amina o carboxilo, a saber, SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) o SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Deje el chip en la solución de tiol O/N para formar una monocapa autoensamblada (SAM).
- Enjuague el chip con etanol y séquelo con gas nitrógeno.
- Si es necesario, almacene el chip funcionalizado durante un máximo de 2 semanas a 4 °C.
- Cuando esté listo para su uso, reaccione el componente SPN o SPC con el ligando utilizando una química que depende del ligando de elección (ver más abajo).
nota: Los chips pueden regenerarse y refuncionalizarse docenas de veces. Un chip determinado se puede utilizar durante períodos que van desde 6 meses hasta más de un año. Los espectros medidos en un conjunto dado se reproducen de forma fiable después de repetidas regeneraciones mediante la fuminación por plasma, seguida de biofuncionalización.
>3. Funcionalización de superficies y caracterización cinética
>Nota: Utilice el chip funcionalizado en el instrumento comercial SPR para caracterizar las constantes de velocidad cinética entre el ligando y el analito, así como para estudiar la resistencia de SAM a la unión no específica. Existe una amplia gama de caudales y diseños microfluídicos que permiten una funcionalización eficiente de la superficie. Dado que tenemos un SPR disponible comercialmente, estandarizamos en torno a sus caudales recomendados. Observamos que estos caudales son típicos de todos los instrumentos SPR y, por lo tanto, no son restrictivos. El instrumento SPR no es una necesidad, ya que toda la funcionalización se puede realizar directamente en el chip de imágenes de resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR), pero redujo nuestra carga de trabajo porque es un instrumento multiplexado, mientras que nuestra configuración microfluídica LSPR no lo es.
- Funcionalice un chip comercial de oro desnudo con el SAM como se describe en la Sección 2.
- Si utiliza un SAM basado en SPC, active el grupo carboxilo con una mezcla 1:1 de 133 mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 33 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) en DDW durante 10 min.
- Conjugar el grupo carboxilo activado con el anticuerpo/ligando de interés durante 300 segundos utilizando un caudal de 30 μl/min. Prepare los ligandos en tampón de fosfato de pH 6, normalmente, pero esto puede variar según la molécula.
- Después de la conjugación del ligando, fluya etanolamina 0,1 M en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como paso desactivador durante 300 segundos a una velocidad de 30 μl/min. La etanolamina ayuda a minimizar la unión inespecífica.
- Introduzca el analito de interés a un caudal de 100 μl/min utilizando un rango de concentraciones y calcule las constantes de velocidad cinética utilizando un software de análisis cinético.
- Si el enlace no específico es problemático, aumente la relación de SPO a SPC o SPN.
>4. Configuración general de LSPR
- Ajustes del microscopio:
- Utilice una lámpara halógena de 100 W para Koehler iluminar la muestra. Utilice un filtro de paso largo (normalmente de 593 nm de corte) en la trayectoria de la luz para eliminar las longitudes de onda que no contribuyen al cambio de resonancia (Figura 1).
- Para la recopilación de datos LSPRi, utilice un microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite 40X (1,4 NA) y una cámara CCD de 16 bits refrigerada termoeléctricamente.
- Coloque un divisor de haz en el puerto de salida del microscopio para obtener imágenes y espectros simultáneamente.
- Ajuste la platina del microscopio con control de temperatura a 37 °C y equilibre durante 4 horas.
- Incorpore un conjunto de incubación adicional en el microscopio para regular la concentración de CO2 y la humedad al 5% y al 95%, respectivamente.
- Preparación y montaje de virutas:
- Funcionalice el chip LSPR como se describe en la Sección 2 con las relaciones SAM óptimas de dos a 8 componentes determinadas a partir de los experimentos SPR.
- Cargue el chip dentro de un soporte microfluídico hecho a medida de la siguiente manera. Coloque el chip en una pieza inferior de aluminio. Coloque el chip entre esta pieza inferior y una junta de silicona y una pieza superior de plástico transparente. Utilice 4 tornillos para sujetar el conjunto.
- Para una aplicación típica de tiol basada en SPC, aplique una capa de 300 μl a una mezcla 1:1 de 133 mM de EDC y 33 mM de NHS en DDW para activar los grupos carboxilo del componente tiol de SPC.
- Espere 10 minutos y enjuague manualmente la superficie con PBS de 10 mM.
- Conjugue el grupo carboxilo activado con el ligando (normalmente un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) de interés mediante una capa de 300 μl de solución de ligando.
- Espere 30 minutos y enjuague manualmente con 10 mM de PBS.
- Aplicar una capa de 300 μl de etanolamina 0,1 M en PBS sobre el chip para minimizar la unión inespecífica. Espere 10 min.
- Lave la etanolamina con PBS que contenga 0.005% Tween 20 (PBS-T20).
- Coloque una pieza de cuarzo sobre el chip para reducir las fluctuaciones en los datos relacionados con un menisco cambiante.
- Mantenga el chip mojado con el tampón PBS-T20 mientras lo monta en el microscopio.
- Coloque el conjunto de chip LSPR firmemente en el portamuestras de la etapa calentada y conecte el tubo microfluídico.
- Conecte el tubo de microfluídica al conjunto y al tampón de flujo (o medios sin suero para estudios celulares) hasta que se alcance un estado estacionario.
- Deje que el conjunto y el microscopio se equilibren durante al menos 2 horas.
- Alinee el chip con un joystick para que la matriz central esté alineada con la fibra óptica para la espectroscopia. Los datos espectroscópicos se toman utilizando un espectrómetro y un software de análisis espectral.
- Mantenga las matrices enfocadas durante todo el experimento mediante el uso de enfoque automático por software, Zeiss Definite Focus o un dispositivo de enfoque automático equivalente.
>5. Imágenes LSPR de secreciones anti-c-myc de células de hibridomas 9E10
Nota: La línea celular de hibridoma utilizada para este estudio expresa constitutivamente el anticuerpo anti-c-myc y, por lo tanto, no requiere un desencadenante químico
- Funcionalizar las nanoestructuras con péptido c-myc. Tiene un valor KD de 1,77 nM para los anticuerpos anti-c-myc secretados por las células de hibridoma clon 9E10.
- Cultivo de las células de hibridoma en un medio de crecimiento completo con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico en un matraz T75 a 37 °C bajo 5% de CO2. Mantenga una densidad celular de 4 ×105 células/ml.
- Para los estudios de secreción celular, las células de pellets del matraz T75 por centrifugación, se lavan dos veces con medios sin suero (SFM) RPMI-1640 para eliminar los anticuerpos secretados y ajustar la densidad celular a 4 ×106 células/ml.
- Recoja las células y pruebe su viabilidad antes de introducirlas en los chips LSPR.
- Introduzca 50 μl de la solución celular manualmente en los chips LSPR con una micropipeta. Después de unos minutos, de 25 a 50 celdas se adhieren a la superficie de los chips LSPR.
- Lave las células restantes en solución con SFM fresco utilizando el sistema de perfusión microfluídica.
- Seleccione las matrices LSPR para obtener imágenes que estén cerca, dentro de 10 μm, pero que no se superpongan con las celdas.
- Para asegurarse de que la señal es específica de los anticuerpos anti-c-myc secretados, introduzca los medios de cultivo celular con y sin los anticuerpos presentes, así como con los anticuerpos, pero con sus sitios de unión bloqueados por la presencia de una concentración saturante de péptido c-myc en la solución.
- Calibrar los sensores al final de cada corrida con una solución saturante de anticuerpos anti-c-myc (250 nM). Esto ayuda a normalizar la respuesta de los sensores y a determinar la ocupación fraccionada en función del perfil de biofuncionalización de cada ejecución.
- Corrija la deriva en las direcciones X e Y utilizando un software de alineación de imágenes.
