Cuantificación de la actividad de secuestro autofágico a granel en células de mamíferos

Resumen

Fuente: Luhr, M. et al., El ensayo de secuestro de lactato deshidrogenasa: un método simple y confiable para determinar la actividad de secuestro autofágico a granel en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2018)

El video muestra un ensayo para evaluar la actividad de secuestro autofágico masivo en células de mamíferos. Utiliza la electroporación para liberar proteínas citosólicas, incluida la lactato deshidrogenasa (LDH). Las fracciones de LDH secuestradas y LDH celular total se determinan para evaluar el secuestro de LDH, proporcionando información sobre la actividad general de secuestro masivo.

Protocolo

1. Siembra y tratamiento celular

1. Cultivo de células adherentes en matraces de cultivo de tejidos de 75^cm2 en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C, utilizando el medio de cultivo preferido para el tipo de célula en cuestión. Permita que las células crezcan hasta que alcancen una capa celular casi confluente.
   nota: Utilice el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) para células LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), BJ, MCF-7 y RPE-1.
   1. Lavar las células con 3 mL 37 °C de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Sustituya el PBS por 3 mL de tripsina-etilendiaminaacetato (EDTA) al 0,25 % (p/v) e incube el matraz en una incubadora humidificada con CO₂ al 5 % a 37 °C hasta que las células se desprendan (2-5 min).
   2. Vuelva a suspender las células desprendidas con un medio de cultivo de 7 mL que contenga 10% de FBS. Mezcle una alícuota de suspensión de celdas de 10 μL con 10 μL de azul de tripano al 0,4 % en un tubo de microcentrífuga, utilizando una punta de pipeta de 0,5-20 μL. Utilice la misma punta de pipeta para llenar inmediatamente un portaobjetos de la cámara de recuento y contar las células en un contador de células automatizado.
2. Prepare una dilución adecuada (ver nota a continuación) de la suspensión celular del paso 1.1.2 utilizando un medio de cultivo que contenga 10% de FBS, y siembre 1 mL de la suspensión celular diluida en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos (área de superficie ~3.8 cm²) utilizando técnica aséptica. Permitir el crecimiento en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C hasta que se haya alcanzado la densidad celular deseada, por ejemplo, 60-90% de confluencia en la cosecha.
   nota: La dilución adecuada de la suspensión celular que dará la confluencia celular deseada en la cosecha variará de un tipo de célula a otro, así como de acuerdo con la duración y el tipo de tratamientos experimentales. Por lo tanto, esto debe ser evaluado empíricamente en cada caso.
   1. Para los experimentos que se van a tratar y cosechar 2 días después de la siembra, siembre 2,5 x 10^{5 celdas} LNCaP, HEK293 o MCF-7, 5 x 10⁴ MEFs, 4 x 10⁵ BJ o 1,5 x 10^{5 celdas} RPE-1 en cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
   2. Para las celdas que se adhieren sin apretar, cubra las placas con el tipo de recubrimiento recomendado para el tipo de celda en cuestión. En el caso de las células LNCaP (y HEK293), se utilizan placas recubiertas con poli-D-lisina (PDL).
   3. Para ello, añadir 500 μL de PDL a 2,5 μg/mL en H₂O estéril a cada pocillo, e incubar las placas en un ambiente estéril durante 30 min a temperatura ambiente (20-25 °C). Retire la PDL con succión y lave cada pocillo brevemente con 1 mL estéril de H₂O.
      nota: Generalmente, el paso 1.2.1 se realiza sin ningún tratamiento experimental. Sin embargo, si se realiza RNAi, puede ser conveniente iniciar una transfección inversa con la siembra.
3. Realizar tratamientos experimentales en pozos duplicados o triplicados por condición.
   1. Por ejemplo, tratar las células con 50 nM del inhibidor de mTOR Torin1, que generalmente es un inductor eficiente del secuestro autofágico, o someter las células a una inanición aguda de suero y aminoácidos lavando las células con 1 mL de medio de solución salina equilibrada de Earle's (EBSS) sin aminoácidos, y posteriormente incubar las células en 1 mL de EBSS en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono (CO₂) a 37 °C.
   2. Deje un conjunto de pozos sin tratar para definir los niveles de fondo de lactato deshidrogenasa sedimentable (LDH).
   3. Añadir una cantidad saturada del inhibidor post-secuestro bafilomicina A1 (Baf) en ausencia o presencia de los tratamientos experimentales, 3-4 h antes de la recolección celular. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C.
      1. Utilice 100 nM Baf para las células LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 y RPE-1, y 10 nM Baf para MEF.
      2. Para los tratamientos experimentales que tienen una duración de solo 3-4 h (como los que se ejemplifican en el paso 1.3.1 típicamente), agregue Baf simultáneamente con los tratamientos. Para tratamientos experimentales más largos, espere hasta 3-4 h antes de la cosecha y agregue 2 μL de un caldo Baf concentrado 500x directamente en el medio.
      3. Mezcle agitando el plato inmediatamente después de la adición de Baf. En este punto, también es recomendable añadir inhibidores del secuestro macroautofágico como controles, por ejemplo, 10 mM del inhibidor de la panfosfoinositida 3-quinasa (PI3K) 3-metil adenina (3MA), o 10 μM del inhibidor selectivo de PI3K clase III SAR-405.

>2. Recolección de células y preparación para la electrodisrupción

1. Al final del período de tratamiento, aspire el medio con succión y agregue 200 μL de solución de desprendimiento de células (precalentada a 37 °C) a cada pocillo. Incubar a 37 °C hasta que las células se desprendan (normalmente alrededor de los 5 minutos).
   nota: Mientras que se puede utilizar tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) en lugar de la solución de desprendimiento de células, esta última contiene DNasa, que ayuda a reducir la viscosidad de las células desprendidas. Siempre que el medio se aspire completamente, no es necesario lavar las células antes de la adición de tripsina-EDTA o solución de desprendimiento celular.
2. Añada 500 μl de PBS a temperatura ambiente (20-25 °C), pH 7,4, que contenga un 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo, y vuelva a suspender con la pipeta hasta que no se vean grumos de células. Transfiera inmediatamente la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
   nota: A menos que se indique lo contrario, realice todos los pasos posteriores con hielo.
3. Sedimentar las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
4. Aspirar a fondo el sobrenadante (con succión) para dejar los gránulos de células lo más secos posible.
5. Agregue 400 μL 10% (p/v) de sacarosa (en H₂O ultrapuro) a cada tubo.

>3. Electrodisrupción de la membrana plasmática y separación de fracciones sedimentables y de células totales

1. Vuelva a suspender el pellet de celda con una pipeta para obtener una suspensión casi de una sola celda y transfiéralo a una cubeta de electroporación de 4 mm.
   nota: Pipetear hacia arriba y hacia abajo ~10-15 veces, utilizando una punta de pipeta de 100-1.000 μL, suele ser suficiente.
2. Coloque la cubeta en un electroporador de onda de decaimiento exponencial y descargue un solo pulso eléctrico a 800 V, 25 μF y 400 Ω; estos ajustes producen un pulso de ~ 8 ms de duración.
3. Utilice una nueva punta de pipeta para transferir la interrupción celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 400 μl de solución de sacarosa tamponada con fosfato helado (100 mM de monofosfato de sodio, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 2 mM de EDTA y sacarosa al 1,75 %, pH 7,5) y mezcle brevemente mediante pipeteo.
   1. Opcional: Para verificar la eficiencia de la electrorrupción de la membrana plasmática, mezcle 10 μL del disruptor celular diluido del paso 3.3 con 10 μL de azul de tripán al 0,4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transfiera a una cámara de conteo y verifique que el porcentaje de células positivas de Trypan Blue sea >99%.
      1. Deje la muestra en la cámara de recuento durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 °C) y verifique que el porcentaje de células positivas para azul de tripano se haya mantenido >99%.
   2. Opcional: Para verificar que la electrodisrupción no ha sido demasiado brusca, es decir, que no ha interrumpido los orgánulos intracelulares, realice los pasos 1.1-3.3 como se describe anteriormente, pero use un material de partida más grande (un pocillo de una placa de 6 pocillos con una capa de células confluentes de ~ 80%) y use 150 μL de sacarosa al 10% en el paso 2.5 y 150 μL de solución de sacarosa tamponada con fosfato sin DTT en el paso 3.3.
      1. Utilice una pipeta para colocar cuidadosamente 200 μL de la solución disruptiva celular diluida sobre un colchón de densidad de 1,2 mL de medio de gradiente de densidad del 8% (p/v) tamponado con fosfato (por ejemplo, 8% Nycodenz, 50 mM de fosfato de sodio, 2,2% de sacarosa, 1 mM de EDTA) en un tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugar a 20.000 x g durante 45 min a 4 °C en una microcentrífuga con función de modo suave (para una aceleración y desaceleración suaves) y colocar cuidadosamente los tubos en hielo.
      2. Retire con cuidado 60 μL de la fracción superior de ~ 200 μL, asegurándose de no recoger ninguna solución de medio de gradiente de densidad, y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga nuevo.
         nota: Este debe contener citosol de pureza excepcional, denominado "savia celular".
      3. Pruebe la pureza de la fracción obtenida en el paso anterior, realizando análisis de Western blot de proteínas contenidas en orgánulos, utilizando técnicas estándar y geles de gradiente del 4 al 20%.
      4. Realizar, por ejemplo, inmunotransferencia para catepsina B, citocromo c y proteína disulfuro isomerasa, para verificar que la descarga eléctrica en el paso 3.2 no ha interrumpido los lisosomas, las mitocondrias o el retículo endoplásmico, respectivamente, e inmunotransferencia para LDH para verificar la presencia de una proteína citosólica en la savia celular.
      5. Paralelamente, se realiza la inmunotransferencia en extractos de proteínas elaborados a partir de la solución de disruptiva celular total para confirmar que los anticuerpos utilizados pueden detectar las proteínas que contienen orgánulos que se están evaluando.
4. Repita los pasos 3.1 a 3.3 para cada muestra.
5. Extraer 550 μL de cada solución diluida de disruptor celular (obtenida en el paso 3.3) a tubos de microcentrífuga de 2 mL que contengan 900 μL de tampón de resuspensión helado (50 mM de monofosfato de sodio, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA y 5,9% de sacarosa, pH 7,5) suplementados con 0,5% de BSA y 0,01% de Tween-20, y mezclar brevemente mediante pipeteo.
6. Centrífuga a 18.000 x g durante 45 min a 4 °C para producir pellets que contienen "LDH sedimentado". Aspirar a fondo el sobrenadante (con succión) para dejar los pellets lo más secos posible. Coloque las muestras en un congelador a -80 °C.
7. Transfiera 150 μL de cada solución diluida de disruptor celular (obtenida en el paso 3.3) a nuevos tubos y coloque las muestras en un congelador a -80 °C. Utilice estas muestras para determinar los niveles de "LDH total" en las células.
   nota: En este punto, el experimento se puede pausar todo el tiempo que se desee.

>4. Extracción de LDH y medición de la actividad enzimática de LDH

1. Descongele las muestras de "LDH sedimentada" (del paso 3.6) y de "LDH total" (del paso 3.7) en el hielo.
2. Añada 300 μL de tampón de resuspensión helado que contenga un 1,5% de Triton X-405 a las muestras de "LDH total" (produciendo una concentración final de Triton X-405 del 1%). Gire las muestras sobre un rodillo en una cámara fría (4-8 °C) durante 30 min.
3. Añada 750 μL de tampón de resuspensión helado con Triton X-405 al 1% a las muestras de "LDH sedimentado" y vuelva a suspender los gránulos con una pipeta hasta obtener una solución homogénea.
4. Centrifugar las muestras de los pasos 4.2 y 4.3 a 18.000 x g durante 5 min a 4 °C para sedimentar los restos celulares no disueltos.
5. Mezcle 4 partes de imidazol frío de 65 mM (pH 7,5)/0,75 mM de piruvato con una parte de imidazol frío de 65 mM (pH 7,5)/1,8 mM de NADH para obtener una solución de trabajo que sea estable durante al menos tres semanas a 4 °C.
6. Mezclar 3-30 μL de los sobrenadantes del paso 4.4 con 200 μL de la solución de trabajo del paso 4.5.
7. Determine la cantidad de LDH midiendo la actividad enzimática de LDH como la disminución de la absorbancia de nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida) (NADH) a 340 nm a 37 °C en comparación con un estándar con una concentración conocida de LDH. Realice mediciones de absorbancia hasta que la reacción se acerque a su finalización, es decir, hasta que la absorbancia a 340 nm ya no cambie con el tiempo.
   nota: Este es el método bioquímico clásico para medir la actividad de la LDH. Aunque el protocolo actual realiza la reacción a 37 °C, también se puede realizar a temperatura ambiente (20-25 °C), lo cual es aconsejable si se realiza espectrofotometría manual. El protocolo actual utiliza un instrumento robótico multianalizador, que de forma automatizada mezcla muestras con solución de trabajo en una placa de 96 pocillos, y mide la absorbancia a 340 nm a 37 °C cada 20 s durante 3 min. A partir de entonces, el software del instrumento calcula la concentración de LDH, expresada como unidades (U)/L, comparando la pendiente de las mediciones de absorbancia a lo largo del tiempo en comparación con una curva estándar obtenida mediante calibración con un estándar de concentración de LDH conocida. El rango lineal de detección mediante este enfoque es de 30 a 1.500 U/L. Como alternativa, existe una amplia variedad de kits disponibles en el mercado para medir la LDH. Algunos de ellos se basan en el acoplamiento de la reacción enzimática a la generación de productos colorimétricos o fluorescentes, permitiendo la detección por otros medios distintos a la espectrofotometría UV, y con otros rangos lineales de detección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y 2 ml	Eppendorf	211-2130 y 211-2120
Placas de 12 pocillos	halcón	353043
Solución de desconexión de celdas Accumax	Tecnologías celulares innovadoras	A7089	Mantener las alícuotas a -20 °C durante años y en la nevera durante unos meses
Bafilomycin A1	Enzo	BML-CM110-0100	Disolver en DMSO
Células BJ	ATCC	CRL-2522	Uso en el pasaje <30
Albúmina sérica bovina (BSA)	VWR	422361V
Cámara de conteo Burker	Fisher Científico	139-658585
Portaobjetos de la cámara de conteo de células Countess	ThermoFisher Scientfic	C10228
Contador de células automatizado Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Cubreobjetos para la cámara de recuento Burker	Fisher Científico	139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26 pocillos, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo)	Bio-Rad	3450034
TDT	Sigma-Aldrich	D0632
Solución salina equilibrada de Earle (EBSS)	Gibco	24010-043	Contiene 0,1% de glucosa
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Cubeta de electroporación (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Electroporador de onda de decaimiento exponencial	Aparato BTX Harvard	EMC 630
Suero fetal bovino (FBS)	sigma	F7524	Concentración final del 10% en medio RPMI 1640
Células HEK293	ATCC	CRL-1573
imidazol	Sigma-Aldrich	56750	Esterilizar en autoclave una solución de 65 mM y conservarla en la nevera durante meses
incubadora; Incubadora de CO2 de calor directo Autoflow IR	NuAire	NU-5510E
Reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX	ThermoFisher	13778150
Células LNCaP	ATCC	CRL-1740	Uso en el pasaje <30
3-metil adenina (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	Stock 100 mM en RPMI a -20 °C. Calentar el stock a 65 °C durante 10 minutos y utilizar a una concentración final de 10 mM
Microcentrífuga refrigerada	Beckman Coulter Ciencias de la Vida	368831
Microcentrífuga refrigerada con función de modo suave	Eppendorf	Eppendorf 5417R
Clorhidrato de MRT67307 (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inhibe la actividad de la quinasa ULK. Disolver en DMSO.
Instrumento MaxMat Multianalyzer	Erba Diagnostics	PL-II
Células MCF7	ATCC	HTB-22
Nadh	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM Suero Reducido Medio	ThermoFisher	31985062
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	20012-019
Puntas de pipeta 3 (0,5-20 μl)	VWR	732-2223	Puntas de barrera Thermo Fischer ART
Puntas de pipeta (1-200 μl)	VWR	732-2207	Puntas de barrera Thermo Fischer ART
Puntas de pipeta (100-1000μl)	VWR	732-2355	Puntas de barrera Thermo Fischer ART
Pipetas	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 Kit GLP
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Prepare una solución madre de 1 mg/ml en H2O estéril. Esta solución es estable a -20 °C durante al menos 1 año.
piruvato	Merck-Millipore	1066190050
Células RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inhibe la fosfoinositida 3-quinasa clase III (PIK3C3). Disolver en DMSO.
Silenciador Seleccionar Control Negativo #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silenciador Seleccione el siRNA dirigido a ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	S35504
Silenciador Select FIP200-targeted siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
Silenciador Seleccionar siRNA dirigido a GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	S22362
Silenciador selecto GABARAPL1 siRNA dirigido (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	S24333
Silenciador selecto GABARAPL2 siRNA dirigido (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
Fosfato de sodio monobásico dihidratado (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
Fosfato de sodio dibásico dihidratado (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	28014.291
sacarosa	VWR	443816T	10% de concentración final en agua; filtrar a través de un filtro de 0,45 μm y conservar en la nevera durante meses
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inhibe la bomba SERCA ER Ca2+. Disolver en DMSO.
Tritón X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% final
Tinte Azul Tripano 0.4%	Sondas moleculares	T10282
Tripsina-EDTA (0,25% p/v de tripsina)	Gibco	25200-056
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich	Página 2287	0.01% final