Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Resumen

Fuente: Schaaf, K., et al. Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia de un fármaco contra el Mycobacterium tuberculosis con macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Protocolo

>1. Condiciones de cultivo para la proteína fluorescente verde que expresa M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP)

NOTA: La cepa auxótropa mc²6206 derivada de M. tuberculosis H37Rv (ΔpanCD, ΔleuCD) transformada con el plásmido pMN437 que expresa gfp (proteína fluorescente verde) se utiliza en todo este protocolo. Es posible sustituir la cepa Mtb-GFP por una cepa de tipo salvaje que no exprese GFP para facilitar el acceso de la cepa a los investigadores. Sin embargo, la expresión de gfp es deseable para permitir la confirmación visual de la fagocitosis y la formación de agregados de Mtb/macrófagos. Para el almacenamiento a largo plazo, los Mtb-GFP se congelaron a -80 °C en medios completos de 7H9 (descritos en el paso 1.1) suplementados con un 20% de glicerol.

1. Prepare medios completos de Mtb-GFP (7H9-C) complementando el medio 7H9 con 10% de Middlebrook OADC (albúmina oleica dextrosa catalasa), 0,02% de tyloxapol, 24 μg/mL de ácido D-pantoténico, 50 μg/mL de L-leucina y 50 μg/mL de higromicina B.
2. Descongele un vial de Mtb-GFP y agregue 10 mL de 7H9-C en un matraz de PETG de fondo cuadrado de 30 mL.
3. Incubar a 37 °C en un agitador rotativo (50 rpm). Realice mediciones de densidad óptica (OD₆₀₀) cada pocos días hasta que OD₆₀₀ alcance 1,0 (aproximadamente 5-8 días).
4. Diluya y deje pasar el cultivo según sea necesario para mantener un diámetro exterior de₆₀₀ entre 0,2 y 1,0.
5. Para la infección, utilizar un cultivo establecido de Mtb-GFP dentro de la fase de crecimiento logarítmico (OD₆₀₀ de 0,6-1). Para evitar cultivos grumosos, sonique el matraz de cultivo Mtb en un baño de agua (130 W; 3 pulsos de 5 s) una o dos veces por semana.

>2. Condiciones de cultivo para células THP-1

1. Prepare el medio celular THP-1 completo (RPMI-C) complementando el medio RPMI 1640 con suero fetal bovino inactivado por calor al 10%, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de ácido HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico).
2. Incubar las células en un matraz T-75 a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂.
3. Cuente las células con un hemocitómetro o citometría de flujo cada dos días y mantenga las células THP-1 a una densidad de entre 0,1 y 0,6 millones por ml.

>3. Protocolo de infección para generar estructuras agregadas de mtb/macrófagos

1. Preparación de la célula THP-1 (por placa de 96 pocillos)
   1. Centrífuga 7 x 10⁶ celdas THP-1 a 250 x g durante 5 min. Resuspender en 7 mL RPMI-C.
2. Preparación Mtb-GFP
   1. Centrífuga 2,8 x 10⁸ Mtb-GFP a 3.200 x g durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante utilizando una conversión de OD₆₀₀ 1,0 = 3 x 10⁸ bacterias/mL.
   2. Lavar una vez con RPMI-C y centrifugar como en el paso 3.2.1.
   3. Vuelva a suspender en RPMI-C de 7 mL y vórtice durante 10 s.
3. Infección
   NOTA: Consulte la Figura 1 para ver la plantilla.
   1. Prepare una placa de 96 pocillos agregando 200 μL de agua estéril en las filas A y H y en las columnas 1 y 12 para un borde de agua para evitar la evaporación del medio de cultivo.
   2. Agregue 200 μL RPMI-C a la columna 2 (B2 a G2) para el control de fondo (en blanco).
   3. Para infectar, agregue la suspensión de Mtb-GFP (paso 3.2) a la suspensión celular THP-1 (paso 3.1) y mezcle bien mediante pipeteo. La densidad final de células THP-1 es de 5 x 10⁵ por ml y la multiplicidad de infección correspondiente es de 40.
   4. Vierta la suspensión THP-1/Mtb-GFP en un depósito de 25 ml.
   5. Agregue 200 μL de suspensión THP-1 / Mtb-GFP a todos los 96 pozos restantes (B3 a G11) usando una pipeta multicanal.
      nota: Si trabaja con varias placas de 96 pocillos, vuelva a suspender regularmente la suspensión THP-1/Mtb restante en el depósito para asegurarse de que se agregue una mezcla uniforme a cada pozo.
   6. Incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 7-10 días.
   7. Cambie el medio cada 2 días retirando lentamente 100 μL de medio gastado de la parte superior de cada pocillo y añadiendo suavemente 100 μL de RPMI-C precalentado con una pipeta multicanal. No vuelva a suspender los pozos y altere los agregados de Mtb/macrófagos en el fondo de los pozos.
   8. Examinar visualmente los pocillos mediante microscopía de fluorescencia (objetivo 4-10X) diariamente, tomando nota del tamaño de los agregados de Mtb/macrófagos. Para el día 7-10, los agregados de Mtb/macrófagos deben ser lo suficientemente grandes (consulte la Figura 2 como referencia) para proceder con las pruebas de eficacia del fármaco (Sección 4).
   9. Si lo desea, capture imágenes de los 96 pozos utilizando un sistema automatizado de imágenes celulares equipado con campos brillantes y conjuntos de filtros GFP para documentar la formación de agregados de Mtb/macrófagos.
      nota: Si los usuarios no tienen acceso a un sistema automatizado de imágenes, se pueden tomar imágenes de pozos representativos utilizando cualquier microscopio apropiado con GFP y capacidades de campo claro.

>4. Ensayo de inhibición del crecimiento para evaluar la eficacia de un fármaco frente al Mtb derivado de agregados de Mtb/macrófagos

1. Preparación de medicamentos (condiciones triplicadas para dos medicamentos)
   NOTA: Consulte la Figura 1A para ver la plantilla.
   1. En una placa separada de 96 pocillos, agregue 125 μL de medio 7H9-C desde B2 hasta G10.
   2. Prepare dos fármacos al doble de la concentración final más alta deseada en 1 mL de 7H9-C para tener en cuenta la dilución en el paso 4.2.4.
   3. Añadir 250 μL de cada fármaco a los pocillos B11-C11-D11 y E11-F11-G11, respectivamente para tratamientos por triplicado.
   4. Con una pipeta multicanal, diluir en serie los fármacos problema dos veces moviendo 125 μL de B11-G11 a B10-G10. Mezclar pipeteando 5 veces en cada paso.
   5. Continúe moviendo 125 μL de columna a columna (de derecha a izquierda) a través de la placa y deténgase después de la columna 4.
   6. Después de mezclar la columna 4, deseche 125 μL en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener ningún fármaco que permita su uso como fondo (en blanco) y controles de crecimiento positivos.
      nota: Como alternativa, siga la plantilla de la Figura 1B para probar las bibliotecas de fármacos. Cada placa de 96 pocillos puede contener 58 fármacos a una sola concentración. Prepare esta placa de medicamento utilizando el doble de la concentración final deseada, ya que se diluirá a la mitad en el paso 4.2.4.
2. Tratamiento farmacológico:
   1. Recupere la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos infectados con Mtb (agregados de Mtb/macrófagos).
   2. Decantar cuidadosamente todos los pocillos relevantes (B2 a G11) con una pipeta multicanal. Realice esto en dos pasos: primero, retire 150 μL sin inclinar la placa y, a continuación, retire el medio restante (~50 μL) inclinando la placa e insertando la punta de la pipeta en el borde inferior del pocillo. Como los agregados de Mtb/macrófagos se adhieren al fondo del pozo, no se debe perder material.
   3. Agregue suavemente 100 μL de medio 7H9-C a todos los pocillos relevantes (B2 a G11) de la placa que contiene los agregados de Mtb/macrófagos.
   4. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de la placa de 96 pocillos que contiene fármaco (paso 4.1) a los pocillos correspondientes de la placa de infección.
   5. Colocar en una bolsa sellada e incubar durante 3 días a 37 °C.

>5. Cuantificación de la eficacia del fármaco mediante el ensayo de microtitulación de resazurina

1. Prepare la solución madre de resazurina a una concentración final de 0,8 mg/mL en_H2O. Filtre a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm de tamaño de poro para la esterilización.
2. Prepare la solución de trabajo de resazurina mezclando la solución madre de resazurina, H₂O y Tween-80 (solución al 20% en H₂O) en una proporción de 2:1:1. Las concentraciones finales son 0,4 mg/mL de resazurina y 5% de Tween-80.
3. Con un lector de placas, configure un programa para leer la fluorescencia a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión cada 30 min durante 24 h a 37 °C. Precaliente el lector de placas a 37 °C.
4. Añada 20 μl de solución de trabajo de resazurina a todos los pocillos relevantes (B2 a G11) de la placa tratada con fármaco (paso 4.11) utilizando una pipeta multicanal.
5. Coloque la placa en el lector de placas e inicie la configuración del programa en el paso 5.3.
   nota: Para facilitar el procesamiento de grandes volúmenes de placas de ensayo, basta con desarrollar el ensayo en una incubadora a 37 °C y realizar lecturas de fluorescencia individuales cada 24 h. Esto también es aplicable a los usuarios que no tienen acceso a un lector de placas con capacidades cinéticas y de incubación.

Resultados

Figura 1: Disposición de la placa de medicamento. (A) Ejemplo de plantilla de la placa de desafío de medicamentos utilizada en el paso 4. Esto permite la prueba paralela de dos fármacos en pocillos triplicados a 8 concentraciones definidas. Como experimento representativo, se utilizó rifampicina (RIF) y moxifloxacina (MOXI) a partir de 2 μM y 2,5 μM, respectivamente. (B

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
7H9	BD Difco	271310	Siga las recomendaciones del fabricante
OADC de Middlebrook	BD Biociencias	212351
Tyloxapol	sigma	T8761	Preparar una solución madre al 20% enH2O; esterilizar con filtro
Sal hemicálcica del ácido D-pantoténico	sigma	P5710	Preparar 24 mg/ml de solución madre enH2O; esterilizar con filtro
L-leucina	MP Biomedicals	194694	Preparar 50 mg/ml de solución madre enH2O; esterilizar con filtro
Higromicina B	EMD Millipore	400051	Preparar 200 mg/ml de solución madre en H2O
Botella de medios de PETG cuadrada de Nalgene	Termo Fisher	2019-0030
Medios RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01
Suero Fetal Bovino	Biológicos de Atlanta	S12450H
L-glutamina	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Lector de placas Cytation 3	Biotek		Intercambiable con cualquier lector de placas fluorescentes y microscopio
Software Gen5	Biotek		Registro y análisis de la coversión de rezasurina
Rifampicina	Fisher Científico	BP2679250	Preparar 10 mg/ml de solución madre en H2O
Clorhidrato de moxifloxacina	Acros Organics	457960010	Preparar 10 mg/ml de solución madre en H2O
Sal sódica de Resazurin	sigma	R7017	Preparar 800 μg/mL de solución madre enH2O; esterilizar por filtro
Preadolescente-80	Fisher Científico	T164500	Preparar una solución madre al 20% enH2O; esterilizar con filtro