Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Día 1
NOTA: Realice todos los pasos descritos a continuación en una cabina de bioseguridad de flujo laminar estéril utilizada para el cultivo de tejidos en un laboratorio BSL-2.
- Descongele las muestras de suero a temperatura ambiente y transfiera 100 μL de cada muestra de suero a un tubo estéril. Inactivación del calor durante 30 minutos a 56 °C, ya sea en un baño de agua o en una termobatidora de temperatura ajustable. Realizar diluciones en serie de 10 veces la muestra de suero que van de 1:1 a 1:1.000 utilizando RPMI-10 frío (RPMI con 10% de suero fetal bovino).
- Transfiera 10 μL de muestra de suero diluido en serie a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos con fondo en V. Incluya dos conjuntos de pozos de control, RPMI-10 solo con RVP y sin muestra de suero, y RPMI-10 solo sin RVP y sin muestra de suero. Configure cada muestra de suero y los controles RPMI-10 por triplicado.
- Retire los RVP de Dengue-1, 2, 3 y 4 del congelador a -80 °C y descongélelos en un baño de agua a 37 °C. Transfiera los RVP descongelados inmediatamente a hielo. Obtenga aproximadamente 170 μL de RVP para cada muestra de suero (10 μL de RVP x 3 pocillos por cada dilución de suero (1:1, 1:10, 1:100, 1:1.000) y 10 μL de RVP x 3 pocillos para cada uno de los RPMI-10 con pocillos de control solo RVP).
- Pipetear 10 μL de RVP en cada pocillo de la placa inferior en V de 96 pocillos que contiene la muestra de suero y en los pocillos de control RPMI-10 con RVP (sin suero). No agregue RVP solo a los pocillos RPMI-10 (sin muestra de suero y sin RVP). Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. Agregue 10 μL de RPMI-10 frío en lugar de RVP a cada pozo de control de RPMI-10 frío solamente (sin muestra de suero y sin RVP).
- Transfiera la placa inferior en V de 96 pocillos a una incubadora e incube la placa durante 1 hora a 37 °C en presencia de 5% de CO2. Mientras se incuba la placa inferior en V de 96 pocillos, limpie la superficie de la cabina de bioseguridad con etanol al 70% y haga funcionar la luz ultravioleta durante 15 minutos.
- Extraiga de la incubadora un matraz T75 completamente confluente de células K562, mezcle bien las células con una pipeta estéril de 5 ml y transfiera 5 ml de células a un tubo cónico estéril de 15 ml.
nota: Las células K562 se mantienen en RPMI-10 y se subcultivan a 1 x 106/mL.
- Cuente el número de células extrayendo 10 μL de células del tubo cónico estéril de 15 mL y mezcle con 10 μL de azul de tripfano. Cuente las células con un hemocitómetro para determinar el número total de células en el tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar el cónico de 15 mL con células a ~1.200 x g durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10 caliente a una concentración de 80.000 células/30 μL de medio (2,66 x 106 células/mL).
- Retire la placa inferior en V de 96 pocillos de la incubadora (paso 1.6), transfiera 30 μl de células K562 a cada pocillo de la placa en V de 96 pocillos y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. Transfiera la placa inferior en V de 96 pocillos a una incubadora e incube la placa durante 1 hora a 37 °C en presencia de 5% de CO2.
- Después de incubar durante 1 h, retire la placa inferior en V de 96 pocillos de la incubadora y centrifugue a ~ 1,200 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, decantar el medio de los pocillos volteando la placa boca abajo en un recipiente que contenga un 10% de lejía.
- Lave las células de cada pocillo resuspendiéndolas en 125 μL de RPMI-10 tibio, mezcle bien con una pipeta y centrifugue la placa a ~1.200 x g durante 5 min. Decantar el medio volteando la placa boca abajo en un recipiente que contenga un 10% de lejía. Repite este paso de lavado dos veces.
- Después del lavado, añadir 100 μL de RPMI-10 tibio a cada pocillo, mezclar hacia arriba y hacia abajo con la pipeta e incubar la placa durante 48 h a 37 °C en presencia de 5% de CO2.
>2. Día 3
- Retire de la incubadora la placa inferior en V de 96 pocillos que contiene 100 μL de células y medios/pocillo y colóquela en un armario de bioseguridad. Con una pipeta multicanal, mezcle el contenido de cada pocillo y transfiera las celdas y los medios a una placa inferior en U de 96 pocillos o a tubos de polipropileno de 5 ml preetiquetados.
- Enjuague cada pocillo en la placa inferior en V de 96 pocillos con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y transfiéralo a los pocillos respectivos en la placa inferior en U de 96 pocillos o en tubos de polipropileno de 5 mL etiquetados desde el paso 2.1 para obtener una concentración final de 0.5% PFA/pocillo o tubo. Mezcle bien con una pipeta multicanal, cubra la placa con papel de aluminio y déjela reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las células.
- Prepare el citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales, por ejemplo) ejecutando celdas K562 sin teñir para calibrar la dispersión lateral y frontal junto con los ajustes de fluorescencia. El único canal de fluorescencia requerido es FL1, ya que GFP es la única fluorescencia emitida por las células. Adquiera ~30.000–50.000 células de cada muestra.
nota: Cualquier citómetro de flujo capaz de leer una sola fluorescencia se puede utilizar para adquirir los datos, ya que las células infectadas con RVP solo emitirán fluorescencia verde debido a la presencia de GFP, y no se necesitan otros canales de fluorescencia.
>3. Análisis de datos
- Analice los datos adquiridos en el citómetro de flujo utilizando cualquier software de análisis de citometría de flujo (consulte la tabla de materiales).
- Establezca la primera puerta basada en FSC-A (dispersión directa – área) frente a FSC-H (dispersión directa – altura) para incluir celdas individuales y excluir los dobletes autofluorescentes del análisis. A continuación, compuerta las celdas con compuerta singlete basadas en SSC-A (dispersión lateral – área) frente a FSC-A para excluir cualquier residuo autofluorescente.
- Analice las células SSC-A frente a FSC-A para la expresión de GFP basada en SSC-A frente a GFP-A. Determine el porcentaje de células GFP+ para cada dilución del suero y las muestras de control estableciendo una puerta alrededor de las células GFP+.
- Determine el porcentaje promedio de células GFP+ para cada dilución de muestra de suero y pocillos de control dividiendo el porcentaje total de células GFP+ en los pocillos triplicados por 3.
- Calcule el aumento del pliegue de la infección dividiendo el porcentaje promedio de células GFP+ en las muestras de suero para cada dilución por el porcentaje promedio de células GFP+ en los pocillos de control RPMI-10 con RVP (sin muestra de suero).
- Grafica la mejora del pliegue (eje y) frente a la dilución (eje x) y realiza análisis estadísticos utilizando ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Tukey para múltiples comparaciones.
