>1. Cribado de posibles nanoinhibidores de TLR4 utilizando las células reporteras
NOTA: Dado que la señalización TLR4 utiliza ambas vías terrestres dependientes de TRIF dependientes de MyD88, se selecciona como objetivo principal para abarcar una amplia gama de vías de señalización TLR. Las células reporteras THP-1-XBlue se utilizan principalmente para examinar la activación de NF-κB/AP-1, mientras que las células THP-1-Dual son para la activación de IRF a partir de la transducción de señal dependiente de TRIF.
- Identificar la dosis óptima de LPS generando una curva dosis-respuesta antes del cribado.
- Diluir la solución de trabajo de LPS hasta una concentración final de 0,01 - 100 ng/mL en medio R10 (realizar la dilución en escala log10). Diseñe el diseño de la placa y diluya en una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Asegúrese de que cada pocillo tenga un mínimo de 110 μL de solución después de la dilución.
- Retire suavemente el medio de cultivo de la placa sembrada con células con un aspirador de vacío.
- Transfiera el medio LPS que contiene R10 preparado en la placa de dilución (1.1.1) a la placa de cultivo de acuerdo con la disposición de las muestras. Incubar la placa a 37 °C (en una incubadora de cultivos celulares) durante 24 h.
- A las 24 h, transfiera cuidadosamente los sobrenadantes (80 μL/pocillo) a una nueva placa de fondo redondo de 96 pocillos. Realice el ensayo de luminiscencia colorimétrica y/o luciferasa en estas soluciones inmediatamente o almacene a 4 °C (varias horas) o -20 °C (días) antes del desarrollo del ensayo><.
nota: El diseño de la disposición de la placa debe ser simple y claro para el experimento y el análisis de datos. Para cada condición, se deben considerar de 2 a 4 réplicas. Incluya siempre un grupo de control negativo (LPS nulo). Se recomienda utilizar células THP-1-XBlue para la activación de NF-κB/AP-1, ya que las células Dual tienen un fondo relativamente alto de activación de NF-κB/AP-1 después de diferenciarse en macrófagos. Sin embargo, es factible utilizar las celdas duales para informar de la activación de NF-κB/AP-1 e IRF.
- Desarrollar el ensayo colorimétrico para la activación de NF-κB/AP-1 y el ensayo de luminiscencia luciferasa para la activación de IRF.
- Para evaluar la activación de NF-κB/AP-1, transfiera 20 μL de sobrenadante de cada muestra a una nueva placa de cultivo de fondo plano de 96 pocillos, y agregue 180 μL de solución de sustrato SEAP precalentada en cada pocillo. Incubar la placa a 37 °C durante 1 - 2 h para permitir el desarrollo del color (rosa a azul oscuro). Recoja la absorción a 655 nm en un lector de placas.
cautela: El tiempo de incubación se puede variar en función del desarrollo del color (30 min hasta la incubación nocturna). Se recomienda esperar hasta que la densidad óptica (O.D.) del color más oscuro alcance más de 1 evitando la saturación del desarrollo del color (O.D >3).
- Para el análisis de la activación de IRF, transfiera 10 μL de sobrenadante de cada muestra a una placa blanca transparente de fondo plano de 96 pocillos. Añadir la solución de luciferasa (50 μL) e inmediatamente recoger la luminiscencia pocillo por pocillo.
nota: Se recomienda encarecidamente utilizar un lector de placas de luminiscencia con función de inyección automática para garantizar la consistencia en la lectura de luminiscencia de pocillo a pocillo y de placa a placa. Si las soluciones de sustrato se inyectan manualmente, asegúrese de que el tiempo de incubación y la configuración de lectura sean constantes para cada pocillo.
- Realizar el ensayo de cribado en varios híbridos de péptido-GNP con una estimulación de LPS de 10 ng/mL (basada en 1.1). Siga el mismo procedimiento en 1.2 para el desarrollo del ensayo reportero.
- Concentrar los híbridos péptido-GNP a 200 nM en un medio R10 utilizando el método de centrifugación. Centrifugar 20 volúmenes de la solución híbrida (10 nM) a 18.000 x g durante 30 minutos y desechar cuidadosamente los sobrenadantes. Recoja los híbridos (en el fondo del tubo) en un tubo, lávelos con PBS dos veces y vuelva a suspender los híbridos en un volumen del medio R10.
- Mezcle volúmenes iguales de los híbridos concentrados y el LPS (20 ng/mL) que contiene el medio R10 para tener una concentración final de los híbridos y LPS de 100 nM y 10 ng/mL, respectivamente.
- Retire el medio de cultivo de la placa cultivada y agregue 100 μL de la solución mezclada en cada pocillo (3 réplicas para cada condición); incluya un control negativo (solo medio) y un control LPS (10 ng/mL LPS sin híbridos).
- Después de 24 h de incubación a 37 °C, transfiera el medio de cada pocillo a un tubo y centrifugue los tubos a 18.000 x g, 4 °C durante 30 min. Recoja los sobrenadantes (50-80 μL/tubo) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos y realice el ensayo reportero como se describe en 3.2.
cautela: Al desechar los sobrenadantes después de la centrifugación, no agite los híbridos en el fondo del tubo.
nota: La centrifugación en el paso 1.3.4 es muy importante para eliminar los híbridos de nanopartículas no internalizadas del medio de cultivo, y puede evitar la interferencia de los híbridos con las lecturas colorimétricas/luminiscentes. Esto se debe a que las nanopartículas de oro pueden absorber amplias longitudes de onda de luz dependiendo de su tamaño y aglomeración.
>2. Validando el efecto inhibitorio de los posibles candidatos
NOTA: Para confirmar el efecto inhibidor de los posibles candidatos del cribado, se emplean dos enfoques. Una consiste en examinar las respuestas a la dosis de los estimulantes (LPS) a una concentración híbrida fija (o al revés); la otra es observar directamente la inhibición de las señales NF-κB/AP-1 e IRF3 a través de inmunotransferencia.
- En el primer enfoque, realizar el ensayo indicador con 100 nM de los híbridos principales y dos concentraciones de LPS a 1 ng/ml y 10 ng/ml siguiendo los mismos procedimientos descritos en el punto 1.3. Incluya un híbrido inactivo (según los resultados de los exámenes de detección) como control híbrido para la comparación.
- Para el enfoque de inmunotransferencia, siga los procedimientos experimentales estándar.
- Cultivo de células THP-1 en medio R10, siembra las células en una placa de cultivo de 12 pocillos (2 x 106 células/pocillo) y diferéncilas en macrófagos tratando las células con 50 ng/mL de PMA durante 24 h seguidas de reposo durante 2 días.
- Después de la diferenciación celular, estimule las células con 10 ng/mL de LPS con/sin los híbridos (100 nM) a lo largo del tiempo (hasta 4 h). En varios puntos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 y 240 min), prepare los lisados celulares para la inmunotransferencia. Incluya un híbrido inactivo como control.
- Pruebe las señales de IκBα, p65 fosforilado e IRF3 fosforilado para examinar el efecto inhibidor de los híbridos principales en la activación de NF-κB e IRF3. Pruebe las señales de β-actina y IRF3 totales como controles internos.
nota: La transducción de señales suele producirse mucho más rápido (en pocas horas) que la expresión de las enzimas reporteras SEAP y luciferasa (24 h). Es muy recomendable realizar también un ensayo de viabilidad de los híbridos ensayados a las 24 h como otro método de validación.
>3. Evaluando la especificidad de TLR
NOTA: Para investigar la especificidad de TLR del híbrido péptido principal-GNP, se prueban otras vías de señalización de TLR, incluyendo TLR2, TLR3 y TLR5. Los TLR7, 8 y 9 se excluyen porque los macrófagos derivados de THP-1 no responden bien a la estimulación de estos TLR debido a la falta de expresión de TLR7, 8 y 9 en los macrófagos.
- Pruebe varias concentraciones (de 1 ng/mL a 25 μg/mL) de los ligandos específicos de TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) y TLR5 (flagelina) en ambos macrófagos derivados de células reporteras para obtener la concentración óptima siguiendo el mismo procedimiento en 1.1 y 1.2.
- Tratar las células con las mezclas del híbrido principal (100 nM) y cada ligando TLR a la concentración obtenida a partir de 3.1 para evaluar la especificidad inhibitoria del híbrido principal de acuerdo con el procedimiento experimental descrito en 1.3. Incluya el híbrido inactivo como control para la comparación.
