Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de órganos
>NOTA: El virus no es estable a temperatura ambiente (RT), por lo que el número de animales capturados a la vez debe planificarse cuidadosamente para preservar los títulos virales.
- Infectar ratones utilizando la dosis y la ruta elegidas, en función del fenotipo requerido. Para este protocolo, infecte ratones machos y hembras de 8-10 semanas de edad con deficiencia del receptor de interferón tipo I (Ifnar1-/-) C57BL/6.
- Anestesiar ratones Ifnar1-/- con un cóctel de Ketamina (90 mg/kg) y Xilacina (10 mg/kg). Pruebe el reflejo del pedal mediante un pellizco firme del dedo del pie para confirmar la anestesia. Administre 1 x 105 5 unidades de formación de foco (FFU) de ZIKV en 50 μL por vía subcutánea (SC) a través de la almohadilla para los pies.
- Preparar todos los materiales necesarios para la cosecha el día anterior 2 tijeras, pinzas y 20 mL de etanol (EtOH) al 70% en un cónico de 50 mL para la desinfección de herramientas.
- Prepare las jeringas y las agujas: una jeringa de 20 ml para perfusión, agujas de 23 g (aproximadamente 1 por jaula) y una jeringa de 1 ml con agujas de 25 g (1 por cada 3-5 ratones). Antes de pesar los tubos, agregue perlas de acero (en el capó) a los tubos con tapa de rosca con junta tórica de 1,5 ml (uno para cada órgano). Los tubos deben ser apropiados para la homogeneización.
- Preparar el día de la cosecha los materiales necesarios para la perfusión y congelación de órganos.
- Llene una cubitera con hielo seco y 70% de EtOH para hacer un baño de hielo. Prepare solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), suponiendo que se necesitan 25-30 mL de PBS por ratón para cada perfusión; 5-10 mL para la médula espinal). Obtenga anestesia, un cóctel de ketamina y xilacina, y suponga 300 μL por ratón. Coloque todos los materiales y los tubos adicionales necesarios para la citometría de flujo, etc., en un contenedor secundario para transportarlos al animalario.
- Siga todos los procedimientos necesarios para ingresar, incluido ponerse y quitarse el equipo de protección personal durante la entrada y salida del animalario.
cautela: Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad certificado dentro de una instalación de laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2).
- Administrar anestesia, 200-500 μL, por vía intraperitoneal dependiendo del tamaño y peso del animal. Si trabaja solo, administre anestesia a un animal a la vez para evitar matar a los animales antes de la extracción de órganos.
- Confirme la dosis de anestesia pellizcando el dedo del pie con pinzas para evaluar el reflejo del pedal. No continúe a menos que no responda por completo. Use alfileres para asegurar el mouse a una placa de cera. En este punto, rocíe al ratón con etanol al 70% para evitar la contaminación del cabello en el procedimiento de extracción de órganos.
- Hemorragia terminal por punción cardíaca.
- Con las tijeras y las pinzas, abra el animal a través de la cavidad torácica para exponer el corazón. Recolecta sangre a través de una punción cardíaca (~ 800 μL), esto se puede usar para múltiples ensayos, incluida la química clínica, la hematología, la citometría de flujo para detectar respuestas específicas de antígenos y la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para el análisis del número de copias virales.
- Para el análisis de ARN viral por qRT-PCR, recoja sangre en un tubo de EDTA si se extrae de sangre completa o en un tubo de microcentrífuga si se extrae de suero. (Para el suero, gire el tubo a máxima velocidad en una centrífuga, a temperatura ambiente, durante 20 minutos, y retire el suero a un tubo separado). Agregue una poliacrilamida lineal como portador a la muestra de suero después de terminar. A continuación, el ARN puede analizarse o almacenarse a -80 °C para su posterior procesamiento.
- Llene la jeringa de 20 ml con PBS, a temperatura ambiente (o 37 °C), y perfunda ratones insertando la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Perfore la aurícula derecha para permitir que la sangre y el PBS salgan. Administre lentamente el PBS mientras verifica el color del hígado para confirmar que el animal está completamente perfundido. El hígado debe cambiar de un color rojo intenso a un color salmón rosado.
- Si prepara los órganos para la histología, deje la aguja de mariposa en su lugar y luego perfunde con 20 ml de paraformaldehído al 4% helado. Si es así, es conveniente tener la jeringa conectada a una llave de paso de 3 vías con ambas jeringas conectadas a ella, activando y cerrando la válvula mientras se alterna entre PBS y PFA.
- Extraiga los órganos en tubos etiquetados y pesados. En el caso de los órganos periféricos, siga un orden establecido para la extracción: hígado, bazo, riñón y pulmones.
- Toma solo un lóbulo del hígado, no importa cuál, pero para todos los experimentos siempre trata de tomar el mismo lóbulo con la misma pieza del mismo tamaño. Del mismo modo, para los riñones y los pulmones, tome el mismo riñón y pulmón. Si también se va a completar la citometría de flujo, se puede cortar cualquier órgano por la mitad. Guarde la mitad que se utilizará para la citometría en el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a temperatura ambiente hasta que se complete la cosecha.
- Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada órgano en un tubo etiquetado y colóquelo en el baño de hielo seco. El título del virus se reduce con el tiempo a temperatura ambiente, por lo que la cantidad de tiempo que se tarda en extraer los órganos es extremadamente importante. Debe haber consistencia entre los ratones, por lo que después de la seguridad, la siguiente prioridad es la velocidad.
nota: Si se extraen órganos para obtener títulos virales, es muy útil que un segundo individuo recoja el cerebro en este punto, para preservar los títulos virales.
- Retire los órganos restantes de la cavidad corporal del ratón para acceder a la columna vertebral y el cráneo.
- Retira el ratón del tablero y retira la piel, seguido de la extracción de los brazos y las piernas.
Retire la cabeza del ratón con tijeras de decapitación, romas o quirúrgicas para extraer el cerebro cortando el cráneo con tijeras LaGrange dentadas a través del foramen magnum. Luego, despegue el cráneo con fórceps y saque el cerebro con una espátula.
- Con unas tijeras fuertes y desafiladas, retire las costillas y otros huesos que rodean la columna vertebral. Luego, corte a través del hueso pélvico, exponiendo el foramen vertebral a nivel lumbar. La pequeña punta de la médula espinal debe ser visible en este punto.
- Use una jeringa de 10 ml llena de PBS y una aguja de 18 g para expulsar la médula espinal "lavando" la médula desde la columna lumbar hasta la columna cervical sobre una placa de Petri.
- Con cuidado, coloque la punta biselada de la aguja dentro del agujero vertebral, evitando una presión excesiva para evitar que la aguja traspase el cuerpo vertebral. Sujete con fuerza para ejercer presión sobre el cuerpo vertebral y la aguja y presione el émbolo de la jeringa para expulsar el cordón. Transfiera inmediatamente la médula espinal al tubo etiquetado y colóquelo en el baño de hielo seco.
- Repita el procedimiento con todos los animales hasta completar la cosecha. Coloque las herramientas de cosecha en el etanol al 70% entre animales. Concéntrese en la consistencia y la velocidad. El tiempo entre cada extracción de órganos debe permanecer constante para no sesgar los resultados de los títulos virales.
- Cuando termine, desinfecte el gabinete de bioseguridad y todo el material antes de sacarlo de la instalación de animales.
- Retire cada tubo del baño de hielo y pese los tubos para determinar el peso del órgano. Para determinar el peso de los órganos, reste el peso del tubo vacío del peso del tubo que contiene el órgano.
NOTA: En este punto, los órganos se pueden congelar a -80 °C para su posterior procesamiento en una fecha posterior o los órganos se pueden homogeneizar inmediatamente antes de congelar alícuotas individuales. Congelar y descongelar muestras varias veces disminuye el título viral. Por lo tanto, es importante realizar el mismo procedimiento para todos los experimentos dentro de un solo proyecto.
>2. Homogeneización de órganos
- Prepare 3 tubos marcados de 1,5 ml con tapón a presión para cada órgano que se va a homogeneizar.
- Si las muestras no se homogeneizan inmediatamente después de la cosecha, retire los tubos a -80 °C. Las muestras no necesitan ser descongeladas para homogeneizarse.
- Coloque las muestras en hielo para mantenerlas frías y minimizar la pérdida de títulos virales. A continuación, añada 1 ml de DMEM frío que contenga un 5% de FBS a cada tubo que contenga órganos.
- Batir inmediatamente los tubos en un batidor de cuentas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Homogeneice todos los órganos con perlas de acero en un instrumento homogeneizador de perlas. Verifique que cada órgano se haya homogeneizado por completo.
- Centrifugar los restos de órganos en un microfuge a 12.000 x g durante 5 min en un microfuge que se haya enfriado a 8 °C. A continuación, vuelva a colocar los tubos en la cubeta de hielo. En la cabina de bioseguridad, alícuotas muestras en tubos para los ensayos necesarios. A continuación, vuelva a colocar los tubos en la cubeta de hielo.
- Para el ensayo de formación de foco, alícuota 500 μL en un tubo marcado. A continuación, coloque los tubos en la rejilla sobre una cubeta de hielo. Alícuota 50 μL en un tubo de ARN para RT-PCR cuantitativa fluorogénica (qRT-PCR) para medir el número de copias del genoma viral.
- Aísle el ARN total de los órganos de los animales infectados utilizando un kit comercial de aislamiento de ARN. Determine el ARN viral del flavivirus utilizando los conjuntos de cebadores-sondas específicos para el ZIKV, que reconocen secuencias únicas en cada genoma del flavivirus. Determine el número de copias virales utilizando un plásmido de control de copias que contenga un ARN monocatenario positivo definido generado in vitro utilizando la polimerasa T7 que contiene las secuencias diana del ZIKV.
- Alicucuota la muestra restante, que es de aproximadamente 300 μL, en el tercer tubo y almacenarla a -80 °C si es necesario.
NOTA: Si las muestras no se congelaron previamente, congele a -80 °C. Si las muestras se han congelado previamente, continúe con el ensayo de formación de foco y/o el aislamiento de ARN antes de detenerse.
>3. Ensayo de formación de foco del virus del Zika
NOTA: Es importante incluir un control sin virus y un control positivo. El control positivo es una serie de dilución de un stock de virus con una concentración conocida. No es necesario que todos los controles estén en la misma placa, pero a medida que el ensayo supera las 5 placas, se deben agregar más controles y distribuirlos entre las placas. Tenga cuidado de no rayar la monocapa con las puntas de las pipetas o con un lavado vigoroso. Se pueden valorar varios órganos en el mismo día o en días diferentes. Sin embargo, no se debe valorar un órgano individual durante varios días, ya que las diferentes condiciones del ensayo pueden afectar el título viral. Se recomienda encarecidamente ejecutar un órgano individual en un solo día.
- Antes del día del ensayo, prepare las células y los reactivos necesarios para el ensayo de formación de foco.
- Prepare un medio de crecimiento que contenga 500 mL de DMEM con 5 mL de HEPES y 25 mL de FBS. Tener células Vero-Organización Mundial de la Salud (OMS) creciendo en medios de crecimiento a 37 °C, 5% de CO2 antes del inicio del ensayo. Las células Vero no deben tener un paso alto ni crecer por encima del 100% de confluencia antes del inicio del ensayo.
- Prepare 500 mL de una solución de metilcelulosa al 2% esterilizando en autoclave un frasco de vidrio de 1 L con 10 g de metilcelulosa y una barra de agitación grande, y un frasco de vidrio de 1 L separado con 500 mL deH2O. Si el agua esterilizada en autoclave se ha enfriado, vuelva a calentar en el microondas hasta que la botella esté caliente al tacto, pero no hirviendo.
- Vierta suavemente agua tibia/caliente en una botella de metilcelulosa mientras está en la campana de cultivo de tejidos. Tape parcialmente el frasco y revuelva en la placa calefactora hasta que la metilcelulosa esté en solución (1-4 h). Alícuota la solución de metilcelulosa al 2% en un tubo cónico estéril de 50 mL. La metilcelulosa al 2% se puede almacenar a 4 °C hasta que se necesite.
- Prepare una solución de paraformaldehído al 5% en PBS para fijar las placas y guárdela a 4 °C hasta que la necesite. Prepare un tampón de lavado de ensayo formador de foco 1x añadiendo Triton X-100 al 0,05% al PBS y almacenado en RT. Prepare un tampón de tinción FFA 1x añadiendo 1 mg/mL de saponina al PBS y almacene a 4 °C hasta que lo necesite. Estos se pueden preparar con una o dos semanas de anticipación.
- Calcule el número de placas de 96 pocillos de fondo plano necesarias para el ensayo, de modo que cada órgano se sitúe en triplicado. Incluya suficientes pozos adicionales para controles positivos y negativos.
- Cultive suficientes células Vero en un medio de crecimiento para completar el ensayo diseñado. Tripsinizar las células Vero y contarlas, resuspendiéndolas a 1,5 x 105 células por mL en medio de crecimiento. Placas de células Vero en las placas de fondo plano de 96 pocillos a 3,0 x 104 células Vero-WHO/pocillo en medio de crecimiento añadiendo 200 μL por pocillo.
- Incube las placas a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche, asegúrese de que las placas estén niveladas en la incubadora para que las células se distribuyan uniformemente dentro del pocillo><.
NOTA: Cada laboratorio cultiva células Vero de manera ligeramente diferente; el objetivo es una monocapa confluente del 90-95% en cada pocillo el día de la prueba para el virus del Zika.
- Diluya las muestras del virus del Zika el día del ensayo. Si las muestras de órganos se han homogeneizado previamente, retire las muestras del congelador a -80 °C y deje que se descongelen antes de colocar las muestras en hielo para el ensayo.
- En el hielo, prepare una placa de 96 pocillos de fondo redondo agregando 180 μL de medio de crecimiento en frío a las filas B a H, dejando la fila A vacía. Añadir 150 μL de cada muestra de órgano homogeneizada a la fila A de la placa inferior redonda.
- Prepare diluciones en serie de 10 veces de cada muestra, utilizando una pipeta multicanal. Diluya las muestras en una placa de 96 pocillos de fondo redondo añadiendo 20 μL de muestra en 180 μL de medio de crecimiento, cambiando las puntas de las pipetas entre cada dilución.
- Prepare la placa de formación de foco retirando los medios de la placa de 96 pocillos de fondo plano que cubre las celdas Vero. Haga esto inmediatamente antes de agregar las muestras de virus para evitar que la monocapa se seque.
- Agregue 100 μL de la dilución del virus a cada pocillo en la placa Vero. Agregue una muestra usando el mismo conjunto de puntas yendo de la concentración más baja a la más alta. Placas de roca de lado a lado de 2 a 4 veces, teniendo cuidado de no girar.
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 1-2 h. Asegúrese de que las placas estén niveladas dentro de la incubadora. Durante la incubación, calentar metilcelulosa al 2% a RT.
- Diluir la solución de metilcelulosa al 2% en un medio de crecimiento. La dilución debe ser en una proporción de aproximadamente 2:1 de metilcelulosa al 2% por medio de crecimiento. Manténgalo a temperatura ambiente hasta que sea el momento de usarlo. Añada 1-2 gotas/pocillo (ajuste la pipeta a 125 μL) de metilcelulosa: medio de crecimiento a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
- Incubar 32-40 h a 37 °C, 5% CO2. Dado que las células Vero de cada persona crecen de manera ligeramente diferente, factores como la confluencia celular y la cepa del virus del Zika pueden cambiar el tiempo de incubación.
- Fije las células Vero con la solución preparada de paraformaldehído al 5%.
- Agregue 50 μL de paraformaldehído al 5% a cada pocillo sobre la capa superior de metilcelulosa en el gabinete de bioseguridad. Incubar durante 60 min en RT. La fijación puede durar toda la noche a 4 °C, pero cubra la placa con parafilm para reducir la evaporación.
- Vierta la superposición y los medios de las celdas en un contenedor de eliminación dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con PBS, 150 μL/pocillo. Retire el PBS de las placas y retire la placa del BSL-2.
- Repita el lavado de PBS 2 veces agregando 150 μL / pocillo. A continuación, retire el PBS. Añadir 150 μL/pocillo 1x tampón de lavado FFA y dejar reposar durante 5-10 min a RT para permeabilizar las células fijas.
- Detectar la infección mediante el uso de anticuerpos primarios contra el Zika. Prepare el anticuerpo primario 4G2 (D1-4G2-4-15) a una concentración de 1 μg/mL en tampón de tinción FFA. Prepare suficientes anticuerpos para todo el ensayo.
nota: Manténgase alejado de los pañales de laboratorio u otro material absorbente con alto contenido de pelusa, ya que las fibras afectarán negativamente las imágenes de los focos.
- Retire el tampón de lavado FFA de las placas. Añadir 50 μL/pocillo del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA. Sellar las placas con parafilm e incubar durante la noche a 4 °C en una plataforma mecedora. El ensayo se puede realizar con una incubación durante 2 h en RT.
- Visualice la infección con la adición de un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Prepare el anticuerpo secundario marcado con HRP anti-ratón de cabra a una concentración de 1:5.000 en el tampón de tinción FFA. Prepare suficientes anticuerpos para todo el ensayo.
- Lave las celdas 3 veces con tampón de lavado FFA, quitando el tampón de lavado deslizándolo hacia el fregadero cada vez. Teñir las células con el anticuerpo secundario en tampón de tinción FFA a 50 μL/pocillo. Incubar 1-2 h en RT.
- Lave las celdas 3 veces con tampón de lavado FFA, quitando el tampón de lavado deslizándolo hacia el fregadero cada vez. Añade 50 μL/pocillo del sustrato Trueblue.
- Observe las placas cuidadosamente, esperando de 2 a 15 minutos hasta que las manchas estén completamente definidas y el fondo sea mínimo. Después de que las manchas sean visibles, lávese suavemente con agua, usando una mano para proteger la monocapa de la fuerza del agua que corre. Seque las toallas de papel (NO los pañales) y la imagen lo antes posible.
- Los puntos se pueden contar manualmente o utilizando un contador de puntos automatizado. Si se cuenta manualmente, se puede usar un osciloscopio de disección para ayudar en la visualización.
- Para cada muestra, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguibles (por ejemplo, de 20 a 200 por pocillo) y calcule el título en unidades de formación de foco por mL (UFF/ml), utilizando el promedio de pocillos duplicados: UFF/mL = (focos medios/pocillo) × (factor de dilución) ÷ (inóculo mL).
