Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Extracción de sangre y aislamiento de plaquetas
- Extraiga sangre humana de donantes adultos sanos que dieron su consentimiento a través de venopunción el día del experimento en citrato trisódico al 3,8%. Un tubo de sangre de 4,5 mL es suficiente para producir suficiente plasma rico en plaquetas (PRP) para 20-25 condiciones en donantes cuyos recuentos de plaquetas son cercanos a 250 x 103 por μL.
nota: Evite extraer sangre con agujas de calibre estrecho (menos de 21 g).
- Prepare el PRP mediante centrifugación a 22 °C y 140 x g durante 12 min con un freno largo. Esto dará como resultado dos capas distintas, con glóbulos rojos en la parte inferior y el PRP de color claro en la parte superior.
- Aísle la capa superior, turbia y amarilla de PRP mediante un pipeteo cuidadoso a través de una punta de pipeta cortada en un ángulo de 45° y obtenga el recuento de plaquetas a través de un hemograma completo (CBC).
- Si es necesario, lavar las plaquetas en solución salina tamponada con sal sódica de ácido 1,4-piperazinedietanosulfónico (PIPES) (cloruro de sodio de 150 mM, NaCl, 20 mM PIPES) en presencia de prostaglandina E1 (PGE1) y volver a suspender en el tampón Tyrode (134 mM de NaCl, 0,34 mM de hidrogenofosfato disódico, Na2HPO4, 2,9 mM de cloruro de potasio, KCl, 1 mM de cloruro de magnesio, MgCl2, 5 mM de glucosa, 12 mM de bicarbonato de sodio, NaHCO3, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico, HEPES, pH 7,35) con 5 mM de glucosa, de lo contrario, proceda al paso 1.5. Los siguientes pasos describen brevemente el lavado.
- Ajuste el volumen de PRP a 10 mL con solución salina tamponada con PIPES y agregue 0,6 μM de PGE1.
- Centrifugar durante 8 min a 1.900 x g, luego desechar el sobrenadante y dejar reposar la pastilla de plaquetas en 400 μL de Tyrode y solución de glucosa durante 5 min.
- Vuelva a suspender suavemente el gránulo de plaquetas y manténgalo intacto durante 30 minutos.
- Ajuste el recuento de plaquetas a ~250 x 103 plaquetas por μL con plasma humano pobre en plaquetas (PPP) combinado y mantenga la suspensión a 22 °C sin perturbaciones o bajo una rotación suave.
>2. Tratamiento de anticuerpos y cizallamiento uniforme
NOTA: Todos los pasos de la sección 2 que requieran pipeteo deben realizarse lentamente, para no introducir ningún cizallamiento.
- Añada el anticuerpo deseado al PRP o a las plaquetas lavadas y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo o agitando con la punta de una pipeta. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 5-10 min. Agregue un volumen equivalente de PPP o búfer de Tyrode a un control negativo.
- Encienda el viscosímetro de placa cónica, ajuste la temperatura de la placa a 22 °C y deje tiempo para que la placa alcance esta temperatura.
- Pipetee el PRP tratado o las plaquetas lavadas en el viscosímetro de placa cónica con control de temperatura directamente en el centro de la placa. Asegúrese de que toda la muestra se deposite entre el cono y la placa en el punto de contacto, y no en el exterior del borde del cono.
- Cizallar a una velocidad y duración adecuadas.
- Calcule el cizallamiento como se indica en el manual del viscosímetro, o como se muestra anteriormente.
- Determine la velocidad de cizallamiento a partir de la viscosidad y el esfuerzo de cizallamiento deseado a través de la ley de viscosidad de Newton;
; la viscosidad del plasma es de 1.5-1.6 centipoise (cP). Por ejemplo, un rango de cizallamiento normal para la circulación humana es de 5-30 dyn/cm2, y el cizallamiento debe aplicarse en la escala de tiempo de un solo dígito por minuto.
- Levante ligeramente el cono de la placa (~2 mm) para que la muestra permanezca en contacto tanto con la placa como con el cono y utilice una punta de pipeta de carga de gel u otra punta de pipeta larga para recoger 5-10 μL desde el centro del volumen de la muestra.
- Incubar las muestras cortadas con los marcadores deseados durante 20 min a temperatura ambiente. Para los marcadores de exposición a fosfatidilserina, β-galactosa y P-selectina, utilice el dominio C2 de lactadherina (LactC2) a 0,08 μM, la lectina de Erythrina cristagalli (ECL) a 6,25 μg/mL y el anticuerpo anti-P-selectina (20 μg/mL), respectivamente.
- Fije las muestras en paraformaldehído al 2% durante 20 min a RT antes de la dilución o el almacenamiento en frío y proceda al paso 3.1 o almacene las muestras a 4 °C durante no más de 12 h.
>3. Detección de marcadores de superficie y reticulación mediante citometría de flujo
- Analice la muestra mediante citometría de flujo, recopilando al menos 20.000 eventos para cada condición.
- Cuantifique la intensidad de la señal de los marcadores fluorescentes utilizando el valor de altura para la intensidad de cada fluoróforo, o la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI).
- Si su objetivo es detectar la reticulación plaquetaria después del tratamiento de cizallamiento, analice la muestra en un citómetro de flujo con capacidad de obtención de imágenes y cuantifique la reticulación por área y parámetros de relación de aspecto.
- Traza un histograma de área y/o relación de aspecto.
- Utilice un control negativo con albúmina sérica bovina (BSA) o vehículo para dibujar una puerta que excluya la mayoría de los eventos completamente circulares (esta puerta generalmente se dibuja con una relación de aspecto ~ 0.8) y cuantifique el porcentaje de eventos dentro de esta puerta. Los eventos con una relación de aspecto más baja tienen más probabilidades de estar reticulados.
