Evaluación del potencial antimicrobiano de los aislados de bacterias fecales murinas productoras de bacteriocinas

Resumen

Fuente: Bäuerl, C., et al. Un método para evaluar los efectos de la bacteriocina en la microbiota intestinal de ratones. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra la detección de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas derivadas de la materia fecal de ratón. El ensayo determina la actividad antimicrobiana de la bacteriocina en cepas bacterianas específicas.

Protocolo

1. Recuento de BAL y actividad de bacteriocinas

1. Pese un gránulo fecal de cada muestra en un tubo de 1,5 ml y agregue un volumen adecuado de NaCl al 0,9% helado para lograr una solución del 10% (p/v). Utilice micromorteros estériles para tubos de 1,5 mL para homogeneizar la suspensión fecal y prepare diluciones en serie diez veces en NaCl al 0,9% helado.
2. Cuente el número total de células BAL.
   1. Transfiera las células diluidas (100 μL) a 4 mL de agar blando Man Rogosa Sharpe (MRS) precalentado (50 °C, agar 0,8%). Mezclar por vórtice antes de verter las células en una placa sólida de agar MRS (agar al 1,5%).
   2. Seque la placa quitando la tapa durante 5 a 10 minutos en la campana estéril antes de incubar las células durante 20 a 24 h a 30 °C para el crecimiento celular y la formación de colonias.
3. Recuento de células productoras de bacteriocina.
   1. Transfiera las células diluidas (100 μL) del productor de bacteriocina a 4 mL de agar blando MRS precalentado (50 °C, agar 0,8%), mezcle por vórtice y vierta las células en una placa de agar MRS (agar 1,5%); esta capa se denomina primera capa.
   2. Transfiera otros 4 mL de agar blando MRS libre de células (agar 0,8%) a la primera capa para incrustar todas las células dentro del agar blando.
      nota: Esta capa está destinada a evitar que las células crezcan como colonias en la superficie de las placas de agar. Las células que crecen en la superficie se desplazan fácilmente al verter las células indicadoras en la parte superior (paso 4.3.4) y, por lo tanto, complicarán la interpretación de los resultados. Esta capa se conoce como la segunda capa.
   3. Seque la placa quitando la tapa durante 5 a 10 minutos en la campana estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 °C para el crecimiento celular y la formación de colonias.
   4. Para identificar las colonias productoras de bacteriocina, mezcle 40 μL de un cultivo nocturno de una cepa indicadora apropiada, con 4 mL de agar blando precalentado. Vierte la mezcla en el plato; Esta capa se conoce como la tercera capa.
   5. Seque la placa quitando la tapa durante 5 a 10 minutos en la campana estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 °C para el crecimiento celular y la formación >nota: Las colonias productoras de bacteriocinas tienen zonas claras (de inhibición) alrededor de las colonias (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Detección de la producción de bacteriocina en BAL recuperada de heces mediante un protocolo de tres capas (como se describe en el procedimiento)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de plástico	Termo Científico	101VR20
Caldo de infusión cerebro-corazón	Conda	Año 1400
Agar bacteriológico europeo	Pronadisa	Año 1800
Agarosa D1 Baja EEO	Pronadisa	8010
1x Tampón TAE	Termo Científico	15558042
Caldo MRS	Difco	288130
Tabletas PBS	sigma	P4417-100TAB
escama	Mettler Toledo	PB602-S