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1. Preparación de bacterias
NOTA: Los sustratos bacterianos de células enteras y los peptidoglicanos purificados se utilizan como sustratos enzimáticos tanto en el ensayo de difusión de microportaobjetos como en el ensayo de liberación de colorante. Estos sustratos requieren preparación antes de llevar a cabo las reacciones enzimáticas. El siguiente protocolo describe su preparación.
- Sustrato de células bacterianas enteras
- Producir sustrato celular bacteriano inoculando 500 ml de caldo de nutrientes con un cultivo nocturno de 2 ml de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubar a 30 °C con agitación (125 rpm) hasta que el cultivo alcance una fase exponencial de crecimiento, definida como una fase de crecimiento rápido que resulta en la duplicación del cultivo bacteriano. Para el cultivo de Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), utilizar caldo nutritivo como medio de crecimiento a 37 °C con agitación (125 rpm).
- Elimine el calor de cada cultivo esterilizándolo en autoclave durante 10 minutos a 121 °C bajo 3 atm de presión.
- Coseche el sustrato bacteriano matado por calor por centrifugación durante 20 min a 5.000 x g. Lave el pellet tres veces con agua Tipo 1 y vuelva a suspenderlo en una cantidad mínima de agua. En este estudio, suspender los sustratos en 1.200 μl.
- Aliquotar 300 μl de los sustratos de las células bacterianas en tubos de microfuga de 1,5 ml y almacenar a 20 °C.
>2. Etiquetado de sustrato - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling
NOTA: En el ensayo de liberación de colorante, el sustrato se une covalentemente al colorante R azul brillante Remazol. El siguiente protocolo describe la preparación de sustratos enzimáticos teñidos.
- Prepare una solución de hidróxido de sodio (NaOH) de 250 mM disolviendo 1 g de NaOH en 99 ml de agua de tipo I para usarla en una solución de colorante R azul brillante (RBB) de Remazol de 200 mM.
- Haga una solución de 200 mM de RBB disolviendo 1,25 g de RBB en 98,75 ml ± 1 ml de una solución fresca de 250 mM de NaOH.
- Vuelva a suspender las células bacterianas muertas por calor a una concentración de 0,5 g de peso húmedo en 30 ml de solución RBB. En el caso del peptidoglicano purificado, vuelva a suspender el peptidoglicano a una concentración de 0,3 g de peso húmedo en 30 ml de solución de RBB.
- Incubar la mezcla de reacción en un matraz Erlenmeyer sobre una plataforma giratoria durante 6 horas a 37 °C con una mezcla suave.
- Transfiera la mezcla de reacción a una incubadora a 4 °C e incube durante 12 horas adicionales con una mezcla suave.
- Después de la incubación, coseche el sustrato teñido por centrifugación a 3.000 x g durante 30 min. Decantar la solución de tinte del pellet de sustrato.
- Elimine el colorante soluble no unido covalentemente de los sustratos lavando las células marcadas con el tinte o el peptidoglicano repetidamente (aproximadamente 3-5 lavados) con agua Tipo I seguido de centrifugación. Con cada adición de agua, vuelva a suspender bien el pellet.
nota: Cuando no está unido, el tinte soluble ya no es visible en el lavado con agua después de la centrifugación. El sustrato debe recibir un lavado adicional. Tenga en cuenta que el sustrato permanecerá azul, mientras que el sobrenadante del último lavado será transparente.
- Almacene los sustratos teñidos suspendidos en una cantidad mínima de agua a -20 °C para su uso posterior.
>3. Ensayo cuantitativo de liberación de colorante
NOTA: Durante el ensayo de liberación de colorante, la hidrólisis del sustrato teñido con RBB en la reacción enzimática libera productos teñidos en el sobrenadante de la reacción. La medición colorimétrica de la cantidad de colorante liberado indica la cantidad de actividad enzimática presente dentro de la muestra para una enzima determinada. El método cuantitativo permite la comparación de diferentes enzimas a través de sustratos y permite la variación de las condiciones ambientales que influyen en la reacción enzimática (por ejemplo, temperatura, salinidad y pH). El siguiente protocolo describe la preparación y el rendimiento del ensayo de liberación de colorante para detectar cuantitativamente la actividad enzimática de las proteínas antimicrobianas.
- Preparación para el ensayo de liberación de colorante
- Deje que el sustrato teñido congelado vuelva a la temperatura ambiente y lave dos veces con tampón de ensayo (solución salina tamponada con fosfato, PBS), que se determina empíricamente para la enzima dada.
- Calcule el volumen de suspensión de sustrato que se necesita multiplicando el volumen de reacción de 200 μl por el número de ensayos de liberación de colorante que se realizarán.
- Preparar la suspensión del sustrato añadiendo sustrato teñido al volumen de tampón de ensayo, determinado en 4.1.2, hasta alcanzar una densidad óptica (OD) de 2,0 a 595 nm utilizando un espectrofotómetro. Para permanecer dentro de las limitaciones funcionales del espectrofotómetro, mida el 2.0 OD595 como 1.0 para una dilución 1:1 de la solución concentrada. Utilice el tampón de ensayo como un espacio en blanco.
nota: La turbidez del sustrato para la reacción se puede elevar más allá de 2.0 para que coincida con los niveles de actividad de enzimas altamente eficientes.
- Suspender la proteína antimicrobiana que se va a evaluar en el tampón de ensayo a una concentración estimada de 1 mg/ml.
- Utilizando el ensayo de microplaca de un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, determine la concentración real de la muestra de proteína que se va a analizar. Ajuste la concentración de la suspensión madre a 1 mg/ml utilizando tampón de ensayo.
- Uso del ensayo de liberación de colorante para determinar las condiciones óptimas de incubación de una proteína antimicrobiana
- Diluir la suspensión antimicrobiana de proteína madre a 100 ng/μl. Esta concentración da una masa de reacción final de 1 μg de proteína por volumen (10 μl) añadido a la reacción del ensayo.
- Determine el rango térmico que se evaluará para la proteína bacteriolítica. El rango térmico en estos ensayos incluyó 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C y 65 °C.
- Realizar los ensayos de reacción en tubos de microfuga de 0,5 ml. Para cada condición térmica, agregue 10 μl de la proteína madre a 200 μl de suspensión de sustrato preparada.
- Incubar en un termociclador durante 8 horas con mezcla por inversión una vez por hora.
- Después de la incubación, detenga las reacciones añadiendo 25 μl de etanol.
- Retire el sustrato insoluble no digerido por centrifugación a 3.000 x g durante 2 minutos y transfiera 150 μl del sobrenadante de reacción para cada mezcla de reacción a una microplaca de fondo plano de 96 pocillos, teniendo cuidado de no alterar el pellet de sustrato no digerido.
- Mida la actividad enzimática de la proteína antimicrobiana para el sustrato dado determinando la cantidad de colorante RBB soluble disociado del sustrato después de la hidrólisis enzimática. Para cuantificar la actividad enzimática, mida la absorbancia del sobrenadante a 595 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas. El aumento de la absorbancia por el colorante soluble liberado en el sobrenadante desde el sustrato marcado es una medida cuantitativa de la actividad enzimática.
nota: El cambio en la absorbancia está representado por unidades de actividad (UA), donde 1 UA da como resultado un aumento de 0,01 en la densidad óptica del sobrenadante de la reacción de liberación de colorante a 595 nm. Se utiliza una reacción en blanco, incubada con todos los componentes de la reacción excepto la enzima, para sustraer cualquier colorante que se libere del sustrato marcado con RBB debido a la incubación. La temperatura enzimática óptima proporciona la unidad de medida de la unidad de actividad máxima.