Un ensayo de placa puntual para evaluar las respuestas al estrés oxidativo en cepas bacterianas

Resumen

Fuente: Ketelboeter, L. M. et al., Métodos para inhibir la producción bacteriana de piomelanina y determinar el correspondiente aumento de la sensibilidad al estrés oxidativo. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra un ensayo de placa puntual diseñado para evaluar las respuestas al estrés oxidativo de las cepas bacterianas. Algunas cepas producen piomelanina, un pigmento antioxidante. Por el contrario, las cepas tratadas con un agente de prueba, que conducen a una reducción de la producción de piomelanina, exhiben una mayor susceptibilidad al estrés oxidativo, lo que resulta en una disminución de la viabilidad celular en comparación con las cepas productoras de piomelanina.

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos y 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)

1. Preparar el caldo de Luria-Bertani (LB) (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,25% de cloruro de sodio, NaCl en_H2O) y alícuota en volúmenes adecuados. Esterilizar en autoclave. Almacene a temperatura ambiente.
2. Preparar 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H₂O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verterlo en platos.
   nota: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB rindarán 4 platos. La cantidad de agar LB se puede modificar para que corresponda al número de placas necesarias para el ensayo.
3. Producir solución salina tamponada con fosfato, PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de cloruro de potasio, KCl, 10 mM de hidrogeno disódico, Na₂HPO₄, 2 mM de fosfato de dihidrógeno de potasio, KH₂PO₄). Esterilizar por autoclave o filtración y almacenar a temperatura ambiente.
4. Prepare las soluciones madre antibióticas para gentamicina, kanamicina y tobramicina.
   1. Preparar concentraciones adecuadas de existencias de antibióticos para las cepas de Pseudomonas aeruginosa que contengan 100 mg/ml de gentamicina, 30 mg/ml de kanamicina y 10 mg/ml de tobramicina. Disolver los antibióticos en agua, esterilizar con filtro (0,2 μm) y almacenar a 4 °C. Modificar los antibióticos y las concentraciones en función de la bacteria estudiada.

>2. Ensayo de placa puntual para la respuesta al estrés oxidativo

1. Establezca cultivos nocturnos de las cepas que se van a analizar. Añadir 2 ml de caldo LB a tubos de ensayo de 16 x 150 mm (uno por cepa) e inocular con 1 colonia aislada de cada cepa. Incubar durante la noche a 37 °C con aireación en un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire.
2. Mida el OD₆₀₀ de los cultivos durante la noche. Lave los cultivos antes de tomar lecturas de OD₆₀₀ para eliminar la piomelanina presente en los medios.
3. Lavar los cultivos centrifugando 1 ml de cultivo en una microcentrífuga a 16.000 x g durante 2 min. Retire el sobrenadante y las células peletizadas sin apretar con una micropipeta, y vuelva a suspender el pellet de células sólidas en 1 ml LB.
4. Al día siguiente, prepare placas de agar LB que contengan H₂O₂ como factor de estrés oxidativo. Un rango de concentraciones de_{H2O2 de} 0 a 1 mM es un buen punto de partida.
   1. Derretir los matraces de agar LB. Enfríe el medio hasta aproximadamente 50 °C a temperatura ambiente.
   2. Agregue H₂O₂ directamente al medio enfriado a las concentraciones deseadas. Agite los matraces para mezclar. Véase la Tabla 1 para las concentraciones de_H2O2 y los volúmenes de_H2O2 concentrados para añadir. Estos valores se basan en 100 ml de agar LB.
   3. Vierta las placas inmediatamente después de agregar H₂O₂ y flamee la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de 4 placas por cada 100 ml de agar LB. Marque las placas con la concentración H₂O₂.
   4. Coloque las placas descubiertas en una campana de flujo biológico con el ventilador encendido durante 30 minutos para eliminar el exceso de humedad de las placas.
      nota: Utilice los platos el mismo día que se preparan. De lo contrario, es posible que los datos sean inconsistentes.
      nota: Los estresores oxidativos como el paraquat pueden sustituirse por el H₂O₂ en este ensayo. Las concentraciones utilizadas para otros estresores oxidativos pueden ser diferentes de las utilizadas para el_H2O2.
5. Lave y mida el OD₆₀₀ de los cultivos durante la noche.
6. Normalice el OD₆₀₀ de todos los cultivos nocturnos al valor más bajo para el conjunto de cepas que se están analizando. P. aeruginosa generalmente tiene un OD₆₀₀ de aproximadamente 2.5 cuando se cultiva durante la noche en LB.
   1. Determine el volumen de cultivo necesario para diluir el cultivo hasta el diámetro exterior más bajo de₆₀₀ en un volumen total de 1 ml. Por ejemplo, si un cultivo tiene un DE₆₀₀ de 3 y el DE₆₀₀ más bajo para el conjunto de cepas es 2,5, realice el siguiente cálculo: (2,5)(1 ml) = (3)(x). x = 0,833 ml. Se colocarán 0,833 ml de cultivo en un tubo de microfuga.
   2. Calcule la cantidad de LB + DMSO necesaria para llevar el volumen de cultivo a 1 ml. Para el ejemplo del paso 4.4.1, la cantidad de LB + DMSO añadida al cultivo sería de 0,167 ml (1 ml de volumen total – 0,833 ml de cultivo). Prepare soluciones madre de LB + DMSO para usar en estas diluciones en función del volumen necesario para diluir todas las cepas.
   3. Mezcle el cultivo y LB + DMSO por vórtice.
7. Para mantener los cultivos en una concentración constante de DMSO, realice diluciones en serie diez veces mayores de los cultivos normalizados durante la noche en PBS + DMSO.
   1. Haga una solución madre de PBS + DMSO. Para un conjunto de diluciones para una cepa, mezcle un volumen de 300 μM de DMSO con PBS para obtener un volumen total de 720 μl. Aumente o reduzca la escala de estas existencias en función de la cantidad de cepas que se analicen.
   2. Etiquete los tubos de microfuga para diluciones en serie de ^10-1 a ^10-7. Añadir 90 μl de PBS + DMSO a los tubos adecuados. Utilice PBS + DMSO para las cepas cultivadas en LB + DMSO.
   3. Añadir 10 μl de cultivo al tubo de dilución ^10-1 adecuado. Mezclar por vórtice y transferir 10 μl de la dilución ^10-1 al tubo de dilución ^10-2. Repita hasta que se hayan realizado todas las diluciones. Cambie las puntas de las pipetas entre diluciones.
8. Localice 5 μl de las diluciones ^10-3 a ^10-7 en placas LB + H₂O₂ duplicadas para cada cepa. Use una punta de pipeta si las manchas están cubiertas de mayor a menor dilución (^10-7 a ^10-3). No incline ni incline el plato hasta que el líquido se haya secado en el plato.
9. Incubar las placas durante 24-48 h a 37 °C (incubadora de aire), dependiendo de la cepa.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 tendrá colonias de buen tamaño en LB después de 24 horas de incubación. Incuba las cepas hasta que tengan colonias aproximadamente del mismo tamaño que la PAO1.
10. Fotografíe las placas con una cámara CCD sobre un transiluminador. Opcionalmente, edite las fotos para contrastar y recórtelas al mismo tamaño. Cuente el número de colonias en cada punto para determinar los cambios en la sensibilidad al estrés oxidativo.

Tabla 1: Concentraciones de H₂O₂ para añadir al agar LB para el ensayo de placa puntual de estrés oxidativo. Esta tabla proporciona varias concentraciones de H₂O₂ y la cantidad correspondiente de caldo concentrado de H₂O₂ para añadir a 100 ml de agar LB.

Concentración final de H2O2 (mM)	Cantidad de 9,79 M H2O2 (30% en peso) para añadir (μl)
0	0
0.2	2.04
0.4	4.09
0.6	6.13
0.8	8.17
1	10.21

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50 mg	También se llama nitisinona. Soluble en DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % en peso en H2O. Estabilizado.