Evaluación de la eficacia de un compuesto de ensayo contra micobacterias en caldo

Resumen

Fuente: Zheng, X., et al. Sistema para el cribado de eficacia y citotoxicidad de inhibidores dirigidos a Mycobacterium tuberculosis intracelular. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un ensayo en caldo para determinar la eficacia antibiótica contra Mycobacterium tuberculosis. El cultivo bacteriano se incuba con diferentes concentraciones de un antibiótico bactericida. La eficacia bactericida se mide evaluando la presencia de bacterias viables mediante un ensayo de resazurina.

Protocolo

1. Cepa bacteriana y medio de crecimiento

1. Prepare la solución de albúmina, dextrosa y salina (ADS) solubilizando 25 g de albúmina sérica bovina, 10,0 g de dextrosa y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 mL de agua desionizada. Filtre-esterilice el ADS y guárdelo a 4 °C.
2. Prepara el caldo 7H9 añadiendo 4,7 g de polvo 7H9 y 2 mL de glicerol a 900 mL de agua purificada. Esterilizar el caldo 7H9 en autoclave a 121 °C durante 10 minutos y dejar que se enfríe a temperatura ambiente antes de continuar. Prepare 7H9ADST agregando 100 mL de ADS y 0.5 mL de Tween80 a 900 mL de caldo 7H9. Conservar a 4 °C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de kanamicina y disolverlo en 1 mL de agua desionizada; la concentración final es de 50 mg/mL. Filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C. Añadir 0,5 mL de solución madre de kanamicina por 1 L de 7H9ADST.
   nota: Este medio debe hacerse fresco, por lo que se deben escalar los volúmenes de acuerdo con el tamaño del cultivo.
4. Cultivo de M. tuberculosis en 7H9ADST suplementado con kanamicina en cultivo permanente. Agite el cultivo diariamente y dilúyalo antes de que el OD₆₀₀ alcance 1.0 para evitar la formación de grumos.
   nota: La cepa de M. tuberculosis utilizada para el desarrollo de este método fue H37Rv transformada con plásmido pJAK2.A. pJAK2.A es un plásmido integrador basado en el vector pMV361, que permite la expresión de alto nivel del gen luciferasa de luciérnaga a partir del promotor hsp60 y puede seleccionarse utilizando kanamicina.

>2. Análisis de la actividad en el caldo utilizando un ensayo de resazurina

1. Cultive M. tuberculosis en 7H9ADST hasta la fase media del registro (~ 0,5 - 0,8 OD600). Diluya el cultivo con el 7H9ADST a 0.01 OD₆₀₀. Diluya los compuestos en 7H9ADST hasta 2 veces las concentraciones de prueba y alícuota 100 μL de cada compuesto diluido en cada pocillo.
2. Transfiera 100 μL de la suspensión bacteriana diluida a cada pocillo. Deje que las placas se incuben a 37 °C en una incubadora humidificada durante 5 días. Disolver 10 mg de resazurina en 100 mL de agua desionizada y un filtro estéril.
3. Agregue 30 μL de solución de resazurina y controle el cambio de color después de 48 h; el crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa.
   nota: También se puede realizar un análisis cuantitativo midiendo la fluorescencia a 590 nm con excitación a 530 - 560 nm o la absorbancia a 570 nm y 600 nm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson y compañía	271210
Tween80	Fisher Científico	T164
Albúmina Bovina pH7	Affymetrix	Año 10857
dextrosa	Fisher Científico	BP350
cloruro de sodio	Fisher Científico	BP358
Sulfato de kanamicina	Fisher Científico	BP906
Resazurina	Alfa Aesar	B21187
glicerol	Fisher Científico	BP229
M. tuberculosis H37Rv
Placa blanca de fondo plano de 96 pocillos	Corning	3917
Placa transparente de fondo plano de 95 pocillos	Corning	3595
Sellador de placas transparentes	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Luminómetro	Biosistemas Aplicados	Tropix TR717