Medición de TEER en células epiteliales irradiadas con rayos X cocultivadas con PBMC

Resumen

Fuente: Babini, G., et al. Un método de cocultivo para investigar la diafonía entre las células Caco-2 irradiadas con rayos X y PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra la medición de la resistencia eléctrica transepitelial en células Caco-2 irradiadas, tanto en presencia como en ausencia de células PBMC. Este método permite estudiar los efectos sinérgicos de la radiación y las células inmunitarias sobre la barrera de células epiteliales.

Protocolo

1. Configuración de irradiación

>Nota: La irradiación de las células Caco-2 se realizó en el departamento de radioterapia del Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavía, Italia) con un acelerador lineal utilizado habitualmente para tratar diferentes tipos de cáncer.

1. Establezca la energía de rayos X de los fotones en un pico de 6 MV. El acelerador lineal funciona en un régimen de impulsos (tiempo entre dos impulsos consecutivos de aproximadamente 4 ms; duración de un solo pulso de aproximadamente 5 μs con una tasa de dosis de hasta 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Coloque las placas de 6 pocillos que contienen insertos con Caco-2 en la trayectoria de los rayos X en una lámina de plexiglás de 1,4 cm de espesor (correspondiente a una distancia ligeramente mayor que la acumulación de la radiación utilizada) a 100 cm de la fuente de radiación.
3. Coloque un bolo de 0,5 cm de espesor en cada muestra antes de que se produzca la irradiación para garantizar el equilibrio del componente de radiación retrodispersado y de las partículas cargadas.
4. Irradiar las células (dosis en el rango de 2 a 10 Gy) con un campo de radiación plano y simétrico (± 2%) de 20 x 20_cm2 y una tasa de dosis de 3 Gy/min.
   nota: Las células de control irradiadas "simuladas" se sometieron a las mismas condiciones de procedimiento que las irradiadas, sin entrar en la sala de irradiación (dosis recibida: 0 Gy)
   cautela: Los dispositivos productores de radiación ionizante deben ser utilizados únicamente por personal especializado.

>2. Resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

1. Siembra 5 × 10^{5 células} de Caco-2 una semana antes de la irradiación en insertos de cocultivo en placa de 6 pocillos (tereftalato de polietileno (PET), 2 x 10⁶ poros/cm2).
2. 1 h antes de la irradiación, mida el TEER con un voltímetro/ohmímetro.
3. Irradie las células como se describe en los pasos 1.1 a 1.4.
4. Incubar las células de Caco-2 en presencia/ausencia de cocultivo con PBMC a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO₂.
5. Durante las primeras horas después de la irradiación, mida la TEER cada hora y, posteriormente, cada 3 horas hasta 48 horas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Insertos de cultivo celular ThinCert de 6 pocillos para placas de pocillos múltiples	Greiner Bio-one	657610	equipo
placa de cultivo celular multipocillo, 6 pocillos	Greiner Bio-one	657160	plástico
placa de cultivo celular multipocillo, 24 pocillos	Greiner Bio-one	662160	plástico
RPMI 1640 sin L-Glutamina	Lonza	12-167F	Reactivos
Voltímetro/ohímetro milicel-ERS	Millipore	MERS 00001	equipo