>1. Iniciación de la biopelícula
- Cultive un cultivo de organismos productores de biopelículas en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton a partir de una calda de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad.
- Incubar durante 16 horas a 37 °C en un agitador rotativo (100-200 rpm).
- Determine el diámetro exterior600 del cultivo utilizando un espectrofotómetro y una cubeta estándar (longitud del recorrido: 1 cm).
- Calcule el volumen (V) de cultivo necesario para preparar 20 ml de inóculo con DE600 (inóculo) de 0,1 en medios del Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) con chelexing utilizando la fórmula: [V = 20 ml*0,1/DE600 (cultivo)].
- Agregue el volumen de cultivo calculado (desde arriba) a un tubo de centrífuga y celdas de pellets girando durante 1 minuto a 10,000 x g. Para preparar el inóculo de biopelícula, aspire el medio de crecimiento gastado y vuelva a suspender el pellet de células en 20 ml de CRPMI.
- Vierta el inóculo en un depósito de 25 ml.
- Retire con cuidado la tapa de una placa de clavija estéril de 96 pocillos tirando de ella hacia arriba.
Nota: Se debe tener cuidado de no contaminar las clavijas que cuelgan de la tapa. La tapa se puede colocar boca abajo sobre una superficie limpia dentro de un gabinete de bioseguridad.
- Con una pipeta multicanal de 200 μl, añada 125 μl de inóculo a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.
- Llene 125 μl de medio CRPMI estéril en cada pocillo de la fila H como control de esterilidad.
- Tome la tapa de la clavija y sujétela por encima de la parte inferior del plato con las clavijas hacia abajo. Alinee cuidadosamente las clavijas individuales con sus respectivos pozos. Evite el contacto físico entre la placa y las clavijas. Una vez alineado, baje la tapa con cuidado. Evite las desalineaciones, ya que los reajustes realizados después de que las clavijas hayan tocado la placa inferior pueden contaminar los controles de esterilidad en la fila H.
- Selle la tapa a la placa con una película de parafina para evitar la evaporación y colóquela en una bolsa de plástico hermética, sellándola herméticamente. Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación.
- Incubar sin agitar a 37 °C durante 48 horas en una incubadora con 5% deCO2.
Nota: 48 horas de crecimiento han sido óptimas para S. aureus, pero variarán según el organismo utilizado.
nota: Aunque la incubación estática es un buen punto de partida para optimizar el ensayo, la agitación suave a 150 rpm en un agitador de microplacas es una posible variación que puede mejorar la formación de biopelículas de algunos aislados de S. aureus.
>2. Preparación de la placa de desafío de biofilm
- El día del desafío de la biopelícula, tome una placa nueva de 96 pocillos y agregue 100 μl de CRPMI, equilibrado a RT, a cada pocillo de las filas B a H. Para evitar resultados inconsistentes, utilice una placa de 96 pocillos que pueda contener 200 μl de medio cuando las clavijas estén adentro, y que cuente con pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación de la biopelícula.
- Diluir hasta 4 compuestos problema por separado en 1,0 ml de CRPMI hasta 2 veces la concentración final deseada, con el fin de tener en cuenta una dilución final en el paso 2.7.
Nota: Un buen punto de partida es 8 veces por encima de la concentración inhibitoria de las células planctónicas.
- Agregue 200 μl del compuesto 1 en los pocillos A1 a A3, el compuesto 2 en los pocillos A4 a A6, el compuesto 3 en los pocillos A7 a A9 y el compuesto 4 en los pocillos A10 a A12.
- Diluir en serie los compuestos problema con una pipeta multicanal y transferir 100 μl de la fila A a la fila B y mezclar.
- De esa manera, continúe transfiriendo 100 μl de pocillo a pocillo. Mezcle después de cada transferencia y deténgase en la fila F.
- Después de mezclar, expulse 100 μl de la fila F a un contenedor de residuos. No transfiera ningún líquido a las filas G y H.
- Añada 100 μl de CRPMI a cada pocillo de la placa con una pipeta multicanal para aumentar el volumen a 200 μl. Consulte la Figura 1 para ver el diseño final de la placa.
3. Desafío de Biofilm
- Agregue 200 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una placa estéril fresca de 96 pocillos que tenga pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación de la biopelícula.
- Retire la bolsa de plástico y la película de parafina de la placa de inicio de la biopelícula incubada.
- Levante la tapa hacia arriba. Evite el contacto entre las clavijas y el fondo de la placa, ya que esto puede dañar la biopelícula. Guarde la parte inferior para el análisis posterior de OD600 (ver 3.8).
- Enjuague las células planctónicas colocando la tapa de la clavija en la placa que contiene PBS (desde el paso 3.1). Sumerja las clavijas durante 5 segundos, levántelas y sumérjalas una vez más, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados del pozo.
- Coloque la tapa de la clavija enjuagada en la placa de desafío. Evite el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que esto dañará la biopelícula y dará lugar a resultados inconsistentes.
- Selle la placa con una película de parafina y colóquela en una bolsa de plástico hermética como se describe en el paso 1.10.
- Incubar la placa sin agitar durante 24 horas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
- Tome la parte inferior de la placa de iniciación de la biopelícula de 3.3. Vuelva a suspender las bacterias en cada pocillo con una pipeta multicanal y mida el diámetro exterior600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento que se produce en todos los pocillos, excepto en los controles de esterilidad en la fila H.
>4. Determinación de biofilm
- Utilice un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinética para detectar la conversión de resazurina. Configure una medición de fluorescencia cinética de 24 horas con una excitación de 530 nm y una emisión de 590 nm.
- Ajuste la temperatura de la cámara a 37 °C y haga que la placa lea cada 20 minutos. Configure el lector de placas para que mida desde la parte inferior de la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Prepare la placa de lavado añadiendo 200 μl de PBS con una pipeta multicanal a una placa estéril de 96 pocillos.
- Prepare el medio de recuperación de biofilm añadiendo 400 μl de solución madre de resazurina de 0,8 mg/ml a 20 ml de medio CRPMI hasta una concentración final de 16 μg/ml de resazurina.
nota: La resazurina es un conocido irritante de la piel. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras contra salpicaduras y guantes mientras manipula. Se utilizó CRPMI como medio de recuperación de biopelícula porque proporciona la señal de fondo más baja, pero puede ser reemplazado por el medio Mueller Hinton si corresponde.
- Añada 150 μl de medio de recuperación de biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa nueva de 96 pocillos.
- Transfiera la placa de desafío de la incubadora a un gabinete de bioseguridad y retire con cuidado la bolsa de plástico y la película de sellado.
- Retire la tapa de la clavija de la placa de desafío y enjuague las células planctónicas en PBS como se describe en 3.4. Conserve la parte inferior de la placa de desafío para el análisis posterior de OD600 (ver 4.10).
- Después de enjuagar, coloque la tapa de la clavija en el fondo de la placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula.
- Envuelva el costado del plato con una película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pozos perimetrales. Inmediatamente después de envolver la placa, colóquela en el lector de placas e inicie una lectura cinética durante un período de 24 horas iniciando el protocolo cinético de resazurina realizado anteriormente desde el paso 4.1.
- Para cuantificar el crecimiento de las células planctónicas que pueden o no ocurrir durante el desafío, lea el diámetro exterior600 de toda la parte inferior de la placa del desafío usando un lector de microplacas. Siga las instrucciones dadas en el paso 3.8.
Nota: Vuelva a suspender con cuidado el contenido de cada pocillo, ya que las células que se desprenden de la biopelícula tienden a crecer en grupos en el fondo del pocillo. Cualquier burbuja dentro del pozo interferirá fuertemente con las lecturas de OD600 y debe evitarse o eliminarse antes de la lectura.
