Un ensayo in vitro basado en fluorescencia para medir la eficiencia de resellado de la membrana plasmática

Resumen

Fuente: Lam, J. G., et al. Medición de alto rendimiento de la eficiencia de resellado de la membrana plasmática en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un ensayo para estudiar la eficiencia de resellado de la membrana plasmática en células de mamíferos. Las células están expuestas a una toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros en la membrana celular. En presencia de iones de calcio extracelulares, el poro provoca la entrada de calcio, induciendo eventos de resellado de la membrana. La eficiencia del resellado se evalúa utilizando un colorante de yoduro de propidio que se une al ADN, que solo ingresa a las células sin una membrana resellada.

Protocolo

1. Preparación

1. Recubrimiento de celdas
   nota: En este protocolo se utilizaron células epiteliales cervicales humanas, HeLa y HeLa que expresan la histona 2B-GFP (H2B-GFP), pero este ensayo se puede adaptar a otras células de mamíferos.
   1. Separe las células adherentes de un matraz de cultivo celular de 75^cm2 lavando las células con 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25%. Sustituya la tripsina usada por 2 mL de tripsina-EDTA fresca al 0,25%.
   2. Incubar las células a 37 °C durante 5 min hasta que las células se hayan redondeado y separado del matraz.
   3. Vuelva a suspender las células en 8 mL de medio de crecimiento (DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina).
   4. Determine la concentración celular utilizando un hemocitómetro y 10 μL de suspensión celular.
   5. Diluir las células en un medio de crecimiento hasta una concentración de 2,5 x 10⁵ células/mL.
   6. Vierta la suspensión celular en un recipiente de pipeta estéril y mezcle bien la suspensión con una pipeta serológica de 10 ml.
   7. Con una micropipeta multicanal de 12 y puntas de 200 μL, distribuya las células HeLa (2,5 x 10⁴ células/100 μL/pocillo) por triplicado (o cuadruplicado) en una placa plana de 96 pocillos, con fondo transparente, tratada con cultivo de tejido de poliestireno negro.
      nota: En la Figura 1 se presenta un arreglo de enchapado como ejemplo.
   8. Cultivar las células durante 24 h en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Preparación de la solución madre
   1. Prepare 1 L de un stock 10x de tampón M (utilizado para preparar M1 y M2) añadiendo 95 g de solución salina balanceada Hanks, 0,476 g de MgCl₂ (5 mM) y 23,83 g de HEPES (100 mM) a 900 mL de agua. Ajuste el pH a 7,4 y aumente el volumen a 1 L. Filtro esterilizante.
   2. Prepare 50 mL de una reserva de glucosa 50x (1,25 M) añadiendo 11,26 g de D-(+)-glucosa a un total de 50 mL de agua. Filtre y esterilice la solución.
   3. Prepare 50 mL de una reserva de calcio 100x (120 mM) añadiendo 0,666 g de CaCl₂ a un total de 50 mL de agua. Filtre y esterilice la solución.
   4. Prepare 50 mL de un stock 10x (50 mM) de etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N', ácido tetraacético (EGTA) añadiendo 0,951 g de EGTA a 40 mL de agua. Aumente el pH a 8 usando NaOH para disolver el EGTA, luego aumente el volumen a 50 mL. Filtre y esterilice la solución.
   5. Para una sola placa de 96 pocillos, prepare 50 mL de Medio 1 (M1, contiene Ca²⁺), 50 mL de Medio 2 (M2, libre de Ca²⁺) y 15 mL de Medio 2 suplementado con EGTA, de la siguiente manera:
      1. Para M1, agregue 5 mL de 10x Buffer M, 0.5 mL de 100x CaCl₂ y 1 mL de glucosa 50x a 43.5 mL de agua.
      2. Para M2, agregue 5 mL de 10x Buffer M y 1 mL de glucosa 50x a 44 mL de agua.
      3. Para M2/EGTA, agregue 1,5 mL de 10x Buffer M y 1,5 mL de 10x EGTA a 12 mL de agua.
         nota: Todas las soluciones que contengan yoduro de propidio (PI) deben prepararse directamente antes de añadirlas a las células.
3. Configuración del lector de placas/citómetro de imágenes
   nota: Utilice un lector de placas multimodo equipado con dos unidades de detección: un espectrofluorómetro y un citómetro de imagen. Limite la exposición a la fluorescencia para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos.
   1. Precaliente el lector de placas a 37 °C antes de realizar el ensayo.
   2. Configure los parámetros para el ensayo cinético en consecuencia dentro del modo Configuración:
      1. Elija Monocromador, FL (fluorescencia) y Cinético para la configuración óptica, los modos de lectura y el tipo de lectura, respectivamente.
      2. En Configuración de longitud de onda, seleccione un paso de banda de excitación y emisión de 9 y 15 nm, respectivamente. Para los ensayos que utilizan yoduro de propidio (PI), ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión a 535 y 617 nm, respectivamente.
      3. En Tipo de placa, seleccione 96 pocillos para el formato de placa y una configuración de placa preestablecida correspondiente a una placa inferior transparente de pared negra.
      4. En Área de lectura, resalte los pozos que se analizarán a lo largo de la cinética.
      5. En PMT y óptica, preestablezca los destellos por lectura en 6 y marque la casilla Leer desde abajo.
      6. En Temporización, inserte 00:30:00 en el cuadro Tiempo de ejecución total para un ensayo cinético de 30 minutos e inserte 00:05:00 para el intervalo.
         Nota: Para cada punto de tiempo y una longitud de onda, el tiempo de lectura de una placa completa de 96 pocillos es de 30 s.
      7. Confirme la configuración especificada en la Información de configuración de la derecha y seleccione Aceptar. Presione Leer para iniciar la ejecución cinética.
   3. Configure los parámetros de imagen en consecuencia dentro del modo Configuración:
      1. Elija Minimax, Imaging y Endpoint para la configuración óptica, los modos de lectura y el tipo de lectura, respectivamente.
      2. En Longitudes de onda, seleccione la luz transmitida y una o ambas cajas de fluorescencia correspondientes a las longitudes de onda de excitación y emisión de 456/541 nm (GFP) y 625/713 nm (PI).
      3. Utilice las mismas opciones para el tipo de placa y el área de lectura que se definen en los pasos 1.3.2.3 y 1.3.2.4.
      4. En Configuración de área de pozo, seleccione el número de sitios dentro de un pozo para obtener una imagen.
         Nota: 12 sitios corresponden a una imagen de pozo completo.
      5. En Configuración de adquisición de imágenes, seleccione los tiempos de exposición para la luz transmitida, 541 (GFP) y 713 (PI). Para GFP, obtenga una imagen de todo el pocillo con un tiempo de exposición de 20 ms/imagen. Para la luz transmitida (TL) y la fluorescencia PI, adquiera una sola imagen del centro de cada pocillo con tiempos de exposición de 8 y 20 ms, respectivamente.
      6. Confirme la configuración especificada en la Información de configuración de la derecha y seleccione Aceptar. El tiempo de adquisición para obtener imágenes de toda la superficie de cada pocillo (12 imágenes/pocillo) de una placa de 96 pocillos y para una longitud de onda es de ~15 min. Presione Leer para iniciar imaging.
         Nota: El tiempo de adquisición de una sola imagen/pocillo de una placa de 96 pocillos requiere ~2,5 min/placa para una longitud de onda. Los parámetros descritos anteriormente corresponden a los equipos específicos de nuestro laboratorio. Mediciones espectrofluorométricas: Una lámpara de destello de xenón que muestra longitudes de onda de excitación en incrementos de 1,0 nm (250-850 nm) con un paso de banda ajustable de 9 o 15 nm, un detector de tubo fotomultiplicador con un rango dinámico de > 6 log y un paso de banda de emisión ajustable de 15 o 25 nm. Citómetro de imagen: Una fuente de luz de iluminación capaz de luz blanca, longitudes de onda de excitación de 460 nm y 625 nm con un paso de banda de 20 nm, filtros de emisión centrados en 541 nm (paso de banda de 108 nm) y 713 nm (paso de banda de 123 nm), respectivamente, y un objetivo 4X acoplado a una cámara de dispositivo de carga acoplada de 1,25 megapíxeles y 12 bits.

2. Ensayo

Nota: En el momento del ensayo, las células deben tener un 70-90% de confluentez. Durante los pasos de lavado, el medio debe retirarse y aplicarse a la pared lateral del pocillo (no directamente encima de las celdas). Mantenga la temperatura de LLO a < 4 °C para evitar su agregación hasta el paso 3.1.5.

1. Prepare un caldo de 30 μM PI en M1 y un caldo de 30 μM PI en M2 precalentado a 37 °C.
2. Lave suavemente las células de la placa 1 con una micropipeta multicanal de 12 y puntas de 200 μL, de la siguiente manera:
   1. Para condiciones permisivas de reparación, retire el medio de crecimiento y lave las células dos veces con 200 μL/pocillo M1 precalentado a 37 °C. Reemplace el medio con 100 μL/pocillo de M1 tibio que contenga 30 μM PI.
   2. Para condiciones restrictivas de reparación, retire el medio de crecimiento y lave las células una vez con 200 μL/pocillo M2 tibio que contenga 5 mM de EGTA para quelar Ca²⁺, seguido de un lavado con 200 μL/pocillo M2. Sustituya el medio por 100 μL/M2 bien tibio que contenga 30 μM PI.
   3. Después de lavar el medio de crecimiento y reemplazarlo con un medio que contenga yoduro de propidio, pase directamente al paso 2.1.3.
3. Placa de imagen 1 bajo luz transmitida, GFP y PI como se detalla en 1.3.3 (precinética). Este paso tarda entre 15 y 20 minutos.
4. Durante el período de 15 minutos del paso 2.1.3, prepare la placa 2 con una micropipeta multicanal de 12 canales y puntas de 200 μL de la siguiente manera:
   1. Coloque una microplaca de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos sobre hielo. Configure la placa utilizando un diseño experimental correspondiente a la placa 1 (Figura 1).
   2. Para condiciones permisivas de reparación, agregue 100 μL/pocillo de M1 helado que contenga 60 μM PI, seguido de la adición de 100 μL/pocillo de M1 helado que contenga 4x LLO o no para el control.
   3. Para condiciones restrictivas de reparación, agregue 100 μL/pocillo de M2 helado que contenga 60 μM PI, seguido de la adición de 100 μL/pocillo de M2 helado que contenga 4x LLO o no para el control.
5. Después de obtener imágenes de la placa 1 (paso 2.1.3), colóquela inmediatamente sobre hielo, utilizando papel de aluminio para separar la placa del contacto directo con el hielo. Deje que el plato 1 se enfríe durante 5 min.
6. Con una micropipeta multicanal de 12 canales y puntas de 200 μL, transfiera 100 μL de cada pocillo a la placa 2 (paso 2.1.4) a los pocillos correspondientes de la placa 1. Para distribuir adecuadamente la toxina en el medio de la placa 1, inserte las puntas debajo del menisco y expulse suavemente el volumen sin introducir burbujas.
   Nota: No pipetee hacia arriba y hacia abajo, ya que esto puede desprender inadvertidamente las células.
7. Deje la placa durante 1 minuto adicional para permitir que la toxina se una a las células y transfiera inmediatamente la placa 1 al lector de placas para el ensayo cinético utilizando el modo espectrofluorómetro (paso 1.3.2).
8. Al final del ensayo cinético, tome inmediatamente la imagen de la placa 1 (postcinética) utilizando el paso 1.3.3.

>3. Análisis: Enumeración de celdas

1. Determine el recuento de células en función de la fluorescencia nuclear utilizando el software de enumeración de células de microplaca.
   1. En Configuración, seleccione Reanálisis y, en la sección de categoría dentro de la Configuración de análisis de imagen, seleccione Análisis de objetos discretos utilizando 541 como longitud de onda para buscar objetos.
   2. Dentro de la opción Buscar objetos, utilizando el método de búsqueda Dibujar en imágenes, seleccione Núcleos en la pestaña de configuración y presione Aplicar.
   3. Presione OK y Read para iniciar el algoritmo de conteo de celdas.

Resultados

Figura 1: Diseño experimental. El diagrama de flujo muestra un diseño de placa representativo configurado para probar el efecto de siete condiciones de prueba en comparación con las células de control no tratadas. Deben incluirse, si procede, controles adicionales, como, por ejemplo, los vehículos destinados a la producción de drogas. Las células se siembran (placa 1) 24 horas antes del experimento. ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x	Dispositivos moleculares	i3x
Citómetro de imagen MiniMax 300	Dispositivos moleculares	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Yoduro de propidio	ThermoFisher Scientific	P3566
Hela	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Tripsina-EDTA 0,25%	ThermoFisher Scientific	25200056
Placa tratada con cultivo de tejido de poliestireno negro de fondo plano Corning de 96 pocillos	Corning	3603
Sales equilibradas de Hanks	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Científico	BP310-500
D-(+)-Glucosa, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG