Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Fijación de tejidos en formol
- Colocar 3-5 mm de tejidos cerebrales recolectados después de la necropsia en una solución de formalina tamponada con fosfato al 10% (proporción de tejido/formalina de 1:20 a 1:50) durante 24-72 h.
cautela: La formalina es un fijador tóxico.
- Registre el peso aproximado del tejido (tamaño), el tipo de tejido (áreas cerebrales) y el volumen de formalina. Es importante que los laboratorios documenten y mantengan registros sobre los tiempos de fijación.
- Para un almacenamiento más prolongado del tejido después de la fijación de la formalina y antes del procesamiento, coloque el tejido en etanol al 70%.
>2. Procesamiento de tejidos
- Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas importantes del cerebro, por ejemplo, secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo (3 lóbulos) o el hipocampo (ambos hipocampos), cada uno cortado de 3 a 5 mm de espesor y colocado en casetes de procesamiento.
- Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina, incrustados en bloques de parafina y seccionados (de 3 a 6 μm) en un micrótomo.
>3. Preparación de materiales / Platos para teñir
- Configure el plato de tinción (Tabla de materiales) como se muestra en la Figura 1. Llene cada plato con 250 ml de la solución.
- Preparación de la solución madre de sustrato 3-amino-9-etilcarbizol (AEC)
- Disuelva un comprimido de 20 mg de 3-amino 9-etilcarbazol (AEC) en 5 mL de N,N, dimetilformamida utilizando una pipeta de vidrio.
cautela: La AEC es un carcinógeno.
- Preparación de la solución madre de proteasa (p. ej., Pronase) para la recuperación del antígeno
- Disuelva 7 mg de la proteasa en 200 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Preparación del tampón de enjuague PBS-T
- Agregue 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Mézclalo bien para formar una solución homogénea.
>4. Desparafinación y rehidratación de tejidos
- Haga una sección de parafina de 5 μm con un micrótomo, hágala flotar en un baño de agua a 38 °C y recójala en portaobjetos de vidrio. Etiquete los portaobjetos con un bolígrafo/rotulador resistente a los reactivos.
- Coloque los portaobjetos en una bandeja y derrita en un horno a 55-60 °C durante 1 hora. No eleve la temperatura por encima de los 60 °C, ya que puede destruir el antígeno viral.
- Retire los portaobjetos del horno y desparafine inmediatamente en 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 min cada uno en los platos 1, 2 y 3.
- Rehidrate las secciones del portaobjetos mediante inmersiones secuenciales en la dilución decreciente de etanol en agua desionizada: (4 a 11 es un enjuague por inmersión) plato 4: xileno/etanol 100% (1:1); plato 5: 100% etanol; plato 6: 100% etanol; plato 7: 95% etanol; plato 8: 95% etanol; plato 9: 80% etanol; plato 10: 70% etanol; plato 11: agua desionizada (Figura 1. Montaje del plato).
cautela: El xileno es un producto químico peligroso y el trabajo debe realizarse en una campana extractora.
>5. Recuperación de antígenos proteolíticos
- Tratar los portaobjetos con la proteasa (2,5 μg/mL de PBS) durante 30 min para la recuperación del antígeno proteolítico en la placa 12.
- A continuación, enjuague en PBS-T durante 10 min (plato 13).
- Tratar con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 14).
- De nuevo, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 15).
>6. Procedimiento de tinción
- Manipule las correderas una a la vez, manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en el tampón (no retire todo el soporte de la corredera, mantenga las diapositivas húmedas). Retire un portaobjetos y seque el exceso de tampón (con una toalla de papel) alrededor de la sección de pañuelo, teniendo cuidado de no alterar la sección de tejido. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad, hecha colocando toallas de papel humedecidas, en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente con suero de cabra normal (bloqueo) durante 15 min.
- Incubar con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminada óptima (dilución 1:250 del suero antirrábico de ratón, no publicado) (control positivo) y anticuerpos de control negativo a temperatura ambiente, igual que el anterior (paso 6.1.) durante 60 minutos sin lavados intermedios.
- Después de 60 minutos, lavar con PBS-T durante 10 minutos (plato 16).
- Incubar con el anticuerpo biotinilado (específico de la especie) en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manejo igual que en el paso 6.1.).
- Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
- Incubar con el complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual que 6,1.).
- Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
- Incubar con sustrato de peroxidasa, amino-etilcarbazol (AEC), en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 min. Prepare AEC justo antes de usar. Para ello, añada 1 mL de solución madre AEC a 14 mL de tampón de acetato 0,1M, pH 5,2. Añadir 0,15 mL de peróxido al 3%,H2O2. Filtrar la mezcla justo antes de usar (filtro de 0,45 μm).
nota: La solución de trabajo de AEC solo es estable durante 2-3 horas. La solución madre AEC se puede almacenar en el refrigerador durante períodos más largos.
- Lavar en agua desionizada durante 10 min (plato 17)
- Contratinción con hematoxilina de Gill diluida 1:2 con agua desionizada durante 2 min (plato 18).
- Enjuague el exceso de hematoxilina con enjuague por inmersión en agua desionizada (platos 19 y 20).
- Enjuague con agua del grifo de Scott durante 30 s (solución azulada) plato 21.
- Lavar en agua desionizada durante 10 min (plato 22)
- Retire las correderas una a la vez: móntelas con un medio de montaje soluble en agua.
- Lea los portaobjetos en un microscopio óptico.
