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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación histopatológica y procesamiento después de obtener una biopsia de la arteria temporal
NOTA: La biopsia de la arteria temporal (TAB) se realiza bajo anestesia local y condiciones estériles por un cirujano certificado. Después de obtener quirúrgicamente una sección arterial de 3 cm en el lado más afectado, la muestra se fija en formol inmediatamente durante 24 h, se divide en secciones de 3 a 4 mm y se incrusta en parafina, prestando especial atención a la correcta alineación del tejido en el bloque que luego se almacena a temperatura ambiente. La selección de la muestra se realiza después de verificar los registros médicos. El diagnóstico se basa en los criterios del Colegio Americano de Reumatología de 1990, que requiere que los sujetos cumplan con 3 de 5 dominios: edad >50 años, dolor de cabeza nuevo, dolor a la palpación de la arteria temporal, una velocidad de sedimentación globular >50 mm/hora por el método de Westergren y una TAB anormal. Por seguridad, se deben usar guantes protectores en todo momento cuando se manipulan muestras. sustancias químicas y anticuerpos.
- A partir de los bloques incrustados, corte secciones de 4-5 μm de grosor con un micrótomo y tiña con hematoxilina y eosina (H&E). Utilice una sección de control de tejido normal seleccionado para garantizar la calidad.
- Flotar las secciones cortadas en un baño de agua tibia calentado a 40 °C para eliminar las arrugas y recogerlas con un portaobjetos microscópico de vidrio recubierto. Coloque los portaobjetos de vidrio en un plato caliente en un horno a 60 °C durante 60 minutos para facilitar el secado y la adherencia de la sección al portaobjetos.
- Coloque los portaobjetos de vidrio en una placa caliente en un horno a 60 °C durante 60 minutos para facilitar el secado y la adherencia de la sección al portaobjetos.
- Monte 3 secciones en portaobjetos de microscopio.
- Coloque los portaobjetos en una rejilla vertical y séquelos durante la noche a 37 °C durante 24 h.
- Coloque los portaobjetos en un recipiente y guárdelos a 4 °C.
>2. Preparación inmunohistoquímica, desparafinado, recuperación de antígenos y tinción
- Cargue las correderas en un bastidor de correderas. Pase la rejilla a través de los platos de la siguiente manera: dos veces en xileno al 100% durante 5 minutos con 10 segundos de agitación suave cada 30 segundos, una vez en etanol al 100% con 10 segundos de agitación, una vez en etanol al 90% con 10 segundos de agitación, una vez en etanol al 70% con 10 segundos de agitación, y dos veces en H2O de doble destilación con 10 segundos de agitación.
nota: La manipulación del xileno y la acetona debe realizarse en campanas ventiladas para evitar la inhalación y la toxicidad respiratoria.
- Recupere el antígeno transfiriendo la rejilla a un recipiente de vidrio con 200 mL de tampón de citrato de pH 6.0 de 10 mmol/L precalentado a 95 °C. Configure el temporizador durante 30 minutos en el baño de agua, luego enfríe a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego enjuague con agua corriente durante 5 minutos.
- Eliminar la actividad de la peroxidasa endógena incubando en 200 mL de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos. Lave los portaobjetos 3 veces en 200 μL de solución salina tamponada con Tris (TBSS).
- Retire los portaobjetos de la rejilla y frote cada uno suavemente para limpiar el exceso de tampón. Para la tinción, agregue 200 μL de los siguientes anticuerpos primarios, agregue cubreobjetos en portaobjetos e incube en una cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente:
Anticuerpo anti-receptor de folato beta (FRB) diluido 1:800
Monoclonal de ratón anti-CD68 humano, dilución 1:200
Conejo policlonal anti-CD3 dilución 1:100
nota: Las secciones de la placenta fijadas en formol e incluidas en parafina también se procesaron como se describe en los pasos 2.1 a 2.9, y se incubaron con anti-FRB18, y se utilizaron como control positivo. Los resultados de la tinción se obtuvieron encontrando la concentración óptima de anticuerpos y se realizaron valorando el anticuerpo en diluciones dobles (p. ej., 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Retire el cubreobjetos después de la incubación y deséchelo. Enjuague los portaobjetos 3 veces durante 2 minutos cada uno con TBSS, drene y limpie el exceso de tampón.
- Añadir 200 μL de solución de anticuerpo secundario que contenga anticuerpo secundario anti-conejo/ratón biotinilado para reaccionar con el anticuerpo primario no conjugado unido al antígeno tisular. Coloque los cubreobjetos en portaobjetos e incube en una cámara húmeda durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Retire el cubreobjetos después de la incubación y deséchelo. Enjuague los portaobjetos 3 veces durante 2 minutos cada uno con TBS, drene y limpie el exceso de tampón.
- Añadir 200 μL de diaminobenzidina (DAB) + tampón de sustrato (Imidazol HCl) -sistema cromógeno e incubar durante 10 minutos para visualizar el patrón de tinción. Lavar con TBSS y luego con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
- Contratinción con hematoxilina durante 3 minutos.
- Monte las guías aplicando 70 μL de medio de montaje a la superficie de la guía. Incline lentamente el cubreobjetos sobre el medio de montaje y evite crear burbujas a medida que lo baja en su lugar. Espere 24 horas para que se seque.
>3. Análisis histopatológico e inmunohistoquímico (IHQ)
Examine las secciones teñidas de H&E e IHC de sujetos normales y positivos para GCA utilizando un microscopio óptico.
- Para las secciones teñidas de H&E
- Evaluar la arquitectura vascular e identificar las células endoteliales en la túnica íntima, las células musculares lisas en la túnica media y los fibroblastos y vasa vasorum en la túnica adventicia.
- Identificar las características de la ACG, que incluyen infiltración de linfocitos y macrófagos/histiocitos, hiperplasia celular y degradación de la lámina elástica interna.
- Analizar el infiltrado linfohistiocítico identificando y cuantificando el número de macrófagos en relación con los linfocitos. Evaluar el grado de disrupción de la lámina elástica interna y los cambios hiperplásicos en las células residentes y compararlos con los controles.
- Para las secciones teñidas con IHC
- Examinar el patrón de tinción de FRB, tomando nota de su expresión por un tipo o tipos particulares de células y su distribución dentro de las capas vasculares y su relación con el infiltrado inmunitario total, el marcador de macrófagos totales, anti-CD68, y el marcador de linfocitos pan-CD3.
- Cuantifique la expresión de las células FRB, CD68 y CD3 contando las células teñidas positivamente en 10 campos de alta potencia (hpf) seleccionados al azar y registre las medias.
nota: La identificación de estas células y estructuras normales y patológicas fue realizada por un patólogo cardiovascular y un reumatólogo certificados, y los resultados se registraron para todos los casos.
- Captura de imágenes representativas con una cámara digital.
NOTA: Después de estos pasos, las alícuotas restantes pueden almacenarse a -80 °C.