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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Recolección de tejidos y reticulación UV
- Eutanasia a 2 ratones adultos con dióxido de carbono (CO2) durante 1-2 minutos o hasta que se detenga la respiración. A continuación, realice la luxación cervical en cada ratón.
- Recolectar alrededor de 100 mg de testículos de ratones de edad apropiada (un testículo adulto en este estudio) para cada experimento de inmunoprecipitación, y colocar los tejidos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
- Retire la túnica albugínea suavemente con un par de pinzas de punta fina.
- Agregue 3 mL de PBS helado en un molinillo de pañuelos y triture el tejido con una fuerza mecánica leve usando un mortero de vidrio suelto (mortero de vidrio tipo A).
NOTA: El propósito de este paso no es lisar las células, sino separar el tejido. La preservación de la viabilidad e integridad de la célula es importante.
- Transfiera la suspensión de tejido a una placa de cultivo celular (10 cm de diámetro) y agregue PBS helado hasta 6 mL.
- Agite el plato rápidamente para que el líquido cubra el fondo del plato de manera uniforme. Si el tejido se muele correctamente, los túbulos seminíferos distribuidos uniformemente serán visibles, mientras que la presencia de grupos de tejido indica que la dispersión del tejido no es óptima.
- Entrecruza la suspensión tres veces con 400 mJ/cm2 a 254 nm sobre hielo. Mezclar la suspensión entre cada irradiación.
nota: Para cada nuevo experimento, se debe optimizar la reticulación.
- Recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mL y granule a 1.200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS y, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 4 °C y 1.000 x g durante 2 min, y retirar el sobrenadante.
- En este punto, proceda inmediatamente con el resto del protocolo, o congele los pellets en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C hasta su uso.
>2. Preparación de cuentas
- Agregue 125 μL de perlas magnéticas de proteína A por muestra (pellet) a un tubo de centrífuga nuevo.
nota: Utilice perlas magnéticas de proteína G para los anticuerpos de ratón.
- Coloque el tubo en el imán para separar las perlas de la solución. Después de 10 s, retire el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lisis helado.
nota: La separación posterior de las perlas magnéticas de proteína A sigue a este paso. La composición del tampón de lisis es de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM de NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; desoxicolato de sodio al 0,5%; Cóctel de inhibidores de proteasas sin ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1/50 (añadir fresco).
- Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de tampón de lisis en frío con 10 μg de anticuerpo eCLIP. Gire los tubos a temperatura ambiente durante 45 min.
nota: La concentración final de anticuerpos para la inmunoprecipitación es de 10 μg/mL. Si se desconoce la concentración de anticuerpos, se debe optimizar la cantidad de anticuerpos.
- Lave las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lisis helado.
>3. Lisis tisular y digestión parcial de ARN
- Vuelva a suspender los gránulos de tejido en 1 ml de tampón de lisis en frío (agregue 22 μL de cóctel de inhibidores de proteínas sin 50x (EDTA) y 11 μL de inhibidor de ARNasa a 1 ml de tampón de lisis).
- Vuelva a suspender dos gránulos reticulados UV y dos gránulos no reticulados por grupo de experimentos: gránulos reticulados UV-1 para la biblioteca eCLIP (UV-1); Pellets UV-crosslinked-2 para la biblioteca eCLIP (UV-2); pellets no reticulados-1 para la biblioteca eCLIP como control (no UV); pellets no reticulados-2 para IgG IP para demostrar la especificidad de los anticuerpos.
nota: El control ideal para la biblioteca eCLIP de los testículos de tipo ancho reticulados por UV es el de los testículos knockout reticulados por UV de ratones de la misma camada.
- Mantenga las muestras lisadas en hielo durante 15 minutos (para evitar la degradación de la proteína y el ARN).
- Sonicar en un sonicador digital al 10% de amplitud durante 5 min, a 30 s encendido/30 s apagado. Coloque siempre la muestra en hielo y limpie la sonda con agua sin nucleasas entre cada muestra.
- Agregue 4 μL de DNasa a cada tubo y mezcle bien. Incubar durante 10 min a 37 °C, agitando a 1.200 rpm.
- Agregue 10 μL de RNasa I diluida (4 U/μL de RNasa I en PBS) y mezcle bien. Incubar durante 5 min a 37 °C, agitando a 1.200 rpm.
- Aclarar el lisado por centrifugación a 15.000 x g durante 20 min (a 4 °C).
- Recoja cuidadosamente el sobrenadante. Deje 50 μL de lisado y deseche el pellet con él.
- Guarde las muestras de entrada como RWB (ejecución para Western blot) y RRI (ejecución para el aislamiento de ARN). Guarde 20 μL (2%) de muestras UV-1, UV-2, no UV e IgG como entradas para la carga de gel RWB. Guarde 20 μL (2%) de muestras UV-1 o UV-2 como entradas para la carga de gel RRI.
4. Inmunoprecipitación
- Añadir 1 mL del lisado (del paso 3.7) a las perlas (preparadas en la sección 2) y rotar las muestras a 4 °C durante 2 h o toda la noche.
- Recoja las cuentas con un soporte magnético y deseche el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 900 μL de tampón con alto contenido de sal (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1 M de NaCl; 1 mM de EDTA; 1% de NP-40; 0,1% de SDS; 0,5% de desoxicolato de sodio), y luego lave las perlas dos veces con 900 μL de tampón de lavado (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM de MgCl2; 0,2% Tween-20).
nota: Para la muestra de IgG, detenga el procedimiento aquí y guárdela en hielo en un tampón de lavado.