1. Preparación del medio y de la solución de tinción
- Prepare el medio completo: Medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 50 μM de beta-mercaptoetanol y 10% de volumen/volumen (v/v) de suero fetal bovino (FBS)
- Prepare el tampón de tinción: solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+/Mg2+ (PBS) con 1% peso/volumen (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
>2. Tratamiento con ratones
- Ratones Balb/c hembra de 7-8 semanas de edad mediante inyección intramuscular (i.m.) en los cuádriceps del vector adenoviral de chimpancé (ChAd3-gag) que expresa el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1-gag con una dosis de 107 partículas virales.
- A los 1-4 meses después del cebado, se administró una inyección i.m. a los ratones el virus vaccinia Ankara modificado que expresa el VIH-1-gag (MVA-gag) con una dosis de 106 unidades formadoras de placa.
- En el día 3 después del refuerzo, sacrifique a los ratones reforzados por dislocación cervical y analícelos en paralelo con ratones no tratados.
- Recolecta los ganglios linfáticos (LN) que drenan los cuádriceps (ilíacos, poplíteos e inguinales) y el bazo de ratones estimulados y no tratados. Además, recoja la médula ósea (BM) de las dos patas traseras de ratones no tratados, y utilice este BM para la configuración del citómetro de flujo y como control positivo para el análisis del ciclo celular (Figura 1).
nota: Genere vectores ChAd3-gag y MVA-gag como se ha descrito anteriormente.
3. Aislamiento de LN drenante, bazo
- Aislamiento de células de bazo y LN
- Coloque 5 mL de medio completo en cada uno de los dos tubos de 15 mL y manténgalos en hielo, listos para que se recojan los órganos.
- Sacrificar un ratón adulto por luxación cervical.
- Coloque el ratón boca arriba y esterilice la superficie de la piel con etanol al 70% v/v.
- Para recolectar LN inguinales, haga una incisión longitudinal de ~ 1 cm en el abdomen con unas tijeras y estire la incisión con las pinzas.
- Visualice los LN inguinales en la superficie interna de la piel y recójalos con las pinzas. Coloque los LN inguinales en uno de los dos tubos de 15 mL preparados en el paso 3.1.1.
- Para recoger el bazo, haga una incisión peritoneal con unas tijeras y extraiga el bazo. Después de cortar el tejido conectivo circundante, coloque el bazo en el segundo tubo de 15 ml preparado en el paso 3.1.1.
- Para recolectar las LN ilíacas, haga los intestinos a un lado y visualice las LN ilíacas cerca de la vena cava inferior, y luego recójalas con las pinzas. Coloque los LN ilíacos en el mismo tubo que contiene los LN inguinales.
nota: Para obtener suficientes células LN para la tinción (ver sección 4), a menudo es necesario agrupar LN poplíteas, inguinales e ilíacas de un ratón. Todos estos LN drenan el cuádriceps (el sitio de la vacunación i.m.). Este protocolo utiliza solo un tubo de 15 mL de LN agrupados.
- Para recolectar LN poplíteos, agarre la piel de las patas traseras y tire suavemente de ella hacia abajo para descubrir los músculos. A continuación, inserte las pinzas entre los músculos situados debajo de la articulación de la rodilla y recoja los LN poplíteos. Coloque los LN poplíteos en el mismo tubo que contiene los LN inguinales e ilíacos.
nota: Véase la nota posterior a 3.1.7.
- Coloque el bazo en un colador de células de 70 μm dentro de una placa de cultivo de 60 mm llena con 5 mL de medio completo. Con un émbolo de jeringa de 5 mL, triture suavemente el órgano hasta su completa disgregación.
- Retire el colador y transfiera la suspensión celular a un tubo limpio de 15 ml.
- Agregue 5 mL de medio completo a la placa de cultivo y lave cuidadosamente la placa y el colador para asegurarse de que se hayan recuperado todas las células. Agrupe con el resto de la suspensión de células del bazo en el tubo de 15 ml.
- Para las LN inguinales, ilíacas y poplíteas combinadas, prepare una suspensión unicelular siguiendo un procedimiento similar al utilizado en los pasos 3.1.9 a 3.1.11 para el bazo.
- Centrifugar las células a 400 × g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos de la célula en PBS.
- Cuente las células con una cámara de Neubauer utilizando tampón de lisis de glóbulos rojos y 0,04% v/v de azul de tripán en PBS.
>4. Tinción del bazo, LN
- Divida las muestras de células que se van a teñir en 3 subgrupos: muestras de células para compensación, incluidas las células BM de ratones no tratados que se van a teñir solo con Hoechst 33342 (en lo sucesivo denominadas Hoechst), y células de bazo de ratones no tratados que se utilizarán para preparar una mezcla de células muertas/vivas para la compensación de colorantes de células muertas; control positivo para el análisis del ciclo celular, que consiste en una muestra de BM de ratones no tratados; y muestras experimentales que contienen muestras de bazo y LN de ratones no tratados y vacunados.
nota: Asegúrese de que haya suficientes células de bazo y LN para el análisis de un número suficiente de células T CD8 específicas de gag. A menudo es necesario utilizar células de bazo agrupadas y células LN agrupadas de 3 ratones vacunados y teñir dos o más muestras idénticas de células agrupadas, cada una de las cuales contiene 3 × 106 células. Fusionar muestras idénticas en el paso de la tinción de Hoechst. Del mismo modo, tiñe las células de bazo agrupadas y las células LN de 3 ratones no tratados, y fusiona muestras idénticas al final. Reserve una muestra no teñida de células de bazo de un ratón no tratado para utilizarla en la configuración del instrumento y la compensación.
- Prepare la mezcla de células muertas/vivas para la compensación del colorante de células muertas (esta mezcla de células se teñirá solo con el colorante de células muertas).
- Calentar un baño maría a 65 °C.
- Tome una alícuota de células del bazo (~3 × 10,6).
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de microfuga, colóquela en el baño de agua a 65 °C durante 5 minutos y luego colóquela inmediatamente en hielo durante 10 minutos.
- Mezcle las células muertas por calor con células vivas del bazo (~3 × 106) en una proporción de 1:1, y transfiera la mitad de la mezcla a una placa inferior redonda de 96 pocillos (~3 × 106 células/pocillo para el control de la tinción de células muertas).
- Tinción de células muertas de muestras experimentales, control positivo para el análisis del ciclo celular y mezcla de células muertas/vivas
- Transfiera el bazo, la LN, las células BM (3 × 106 células/pocillo) y la mezcla de células muertas/vivas (sección 4.2) a una placa de fondo redondo de 96 pocillos, de acuerdo con el esquema de tinción (paso 4.1), y centrifugar a 400 × g durante 3 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender cada gránulo de célula en 50 μL de colorante de células muertas diluido en PBS y vuelva a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces inmediatamente.
- Incubar durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.
- Lave las células 2 veces con tampón de tinción; la primera vez con 200 μL y la segunda vez con 250 μL. Para cada lavado, centrifugar la placa a 400 × g durante 3 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 20 μL de PBS.
- Tinción de células de membrana con complejos de histocompatibilidad mayor (MHC)-multímeros peptídicos y anticuerpos monoclonales (mAbs).
- Teniendo en cuenta los volúmenes necesarios según el esquema de tinción (Configuración del citómetro de flujo, Tabla 1), prepare los siguientes reactivos:
- Diluir mAb 2.4G2 en el tampón de tinción de acuerdo con la dilución apropiada (ver Tabla de Materiales); para cada muestra a teñir, use 10 μL de esta dilución.
NOTA: El mAb 2.4G2 bloquea la unión no específica de antígeno de las inmunoglobulinas a los receptores FcγIII y FcγII.
- Diluir el tetrámero marcado con aloficocianina (APC) H-2k(d) AMQMLKETI (Tetr-gag) en el tampón de tinción para obtener la dilución adecuada (ver Tabla de Materiales); para cada muestra a teñir, use 20 μL de esta dilución.
- Prepare la mezcla de anticuerpos diluyendo mAbs en el tampón de tinción de acuerdo con la dilución apropiada (ver Tabla de Materiales) que se haya determinado previamente en los experimentos de valoración; para cada muestra a teñir, use 20 μL de esta mezcla de anticuerpos.
nota: En este caso, se utilizaron la proteína clorofílica peridinina anti-CD3e (PerCP-Cy5.5) (clon 145-2C11), la ultravioleta brillante anti-CD8a (BUV805) (clon 53-6.7) y la ficoeritrina cianina 7 (PECy7) (clon MEL-14) anti-CD62L.
- Añadir 10 μL del mAb 2.4G2 previamente diluido (paso 4.4.1.1), e incubar durante 10 min a 4 °C, protegido de la luz.
- Añadir 20 μL del Tetr-gag APC previamente diluido (paso 4.4.1.2) y 10 μL de H-2k(d) AMQMLKETI ficoeritrina (PE) pentámero (pent-gag). Incubar durante 15 min a 4 °C, protegido de la luz.
- Añadir 20 μL de la mezcla de anticuerpos previamente preparada (paso 4.4.1.3) e incubar durante 15 min a 4 °C, protegido de la luz.
nota: Por lo tanto, el volumen final es de 80 μL por pocillo (paso 4.3.5, pasos 4.4.2 a 4.4.4).
- Lave las células con 200 μL de tampón de tinción. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender el gránulo celular en 250 μL de tampón de tinción y transfiera la suspensión celular a tubos de 5 mL. Añadir 1 ml de tampón de tinción al tubo y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
- Tome la alícuota de células BM (3 × 106 células) (véase la lista de muestras de células, sección 4.1) que se utilizará para compensar el canal de Hoechst (Hoechst 33342 es excitado por un láser ultravioleta (ajustes del citómetro de flujo (Tabla 2)), y transfiera la suspensión de la célula a un tubo de 5 mL. Añadir 1 ml de tampón de tinción al tubo y centrifugar 400 × g durante 5 min a 4 °C.
>5. Fijación/permeabilización
- Prepare un nuevo tampón de fijación/permeabilización diluyendo 1 parte de concentrado de fijación/permeabilización con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Deseche el sobrenadante y pulse el vórtice de las muestras para desagregar completamente el pellet.
- Añada 1 mL del tampón de fijación/permeabilización recién preparado a cada tubo, incluido un tubo con células de bazo sin teñir (3 x 106, ver lista de muestras de células, sección 4.1) y vórtice.
- Incubar durante 16 h a 4 °C.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
>6. Tinción intracelular
- Tinción Ki67
- Prepare el tampón de permeabilización fresco 1x diluyendo el tampón de permeabilización 10x con agua destilada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes de su uso, el tampón de permeabilización 1x debe filtrarse a través de un filtro de 0,45 μm para eliminar los agregados.
- Diluir el isotiocianato de fluoresceína mAb Ki67 (FITC) (clon SolA15) en tampón de permeabilización 1x (ver Tabla de Materiales), según se determinó previamente en experimentos de valoración (volumen final de 100 μL por muestra).
- Añadir 3 mL de tampón de permeabilización 1x a cada tubo y centrifugar a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Deseche el sobrenadante y repita el paso 6.1.3.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 100 μL de mAb Ki67 FITC previamente diluido (paso 6.1.2).
- Incubar durante 30 min en RT, protegido de la luz.
- Lave las celdas 2 veces con 4 mL de tampón de permeabilización 1x. Para cada lavado, centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT.
- Vuelva a suspender el pellet celular en PBS considerando los siguientes volúmenes: 350 μL de PBS para las muestras que se van a adquirir directamente en el citómetro de flujo; 250 μL de PBS para las muestras que se van a incubar con Hoechst poco antes de la citometría de flujo (sección 6.2).
- Tinción de ADN
- Añadir 250 μL de 4 μg/mL de Hoechst en PBS a cada muestra (la concentración final de Hoechst es de 2 μg/mL).
NOTA: En caso de que se hayan preparado dos o más muestras idénticas de 250 μL en PBS, fusionarlas en este paso y añadir un volumen igual de 4 μg/mL de solución de Hoechst en PBS (la concentración final de Hoechst es de 2 μg/mL). El número de células influye en gran medida en el paso de tinción del ADN. Utilice el mismo número de celda en cada muestra. Tenga en cuenta que incluso un número de células ligeramente reducido (por ejemplo, debido a la pérdida de células en los pasos de lavado anteriores) da como resultado una mayor unión de Hoechst al ADN y una mayor intensidad de Hoechst.
- Incubar durante 15 min en RT, protegido de la luz.
- Centrifugar las muestras a 400 × g durante 5 min en RT.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 350 μL de PBS.
>7. Preparación de muestras de cuentas de compensación
- Prepare 5 μL del anticuerpo diluyendo adecuadamente el mAb en el tampón de tinción.
nota: Para cada mAb conjugado con fluorocromo utilizado en el experimento, prepare su correspondiente muestra de perlas de compensación.
- Vortex Negative Control y Anti-Rata/Hámster Ig,κ Comp Beads antes de su uso.
- Para cada muestra, introduzca una gota (~20 μL) de CompBeads de Control Negativo y una gota de CompBeads de Ig,k Anti-Rata/Hámster.
- Añada 5 μL del anticuerpo prediluido (paso 7.1) al tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo.
- Incubar durante 15 min a 4 °C, protegido de la luz.
- Lave las muestras con 2 mL de tampón de tinción. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet añadiendo 500 μL de PBS a cada tubo y vórtice.
>8. Configuración del instrumento y la compensación y adquisición de muestras experimentales en el citómetro de flujo
>NOTA: Consulte la configuración del citómetro de flujo (Tabla 2) para conocer la configuración del citómetro.
- Configuración general del instrumento y de la compensación
- Abra el software para la adquisición de muestras (consulte Tabla de materiales) y cree un nuevo experimento haciendo clic en Nuevo experimento en la sección de la cinta del espacio de trabajo y seleccionando Nuevo experimento en blanco.
- Haga doble clic en el experimento creado para abrirlo.
- En la ventana Configuración del citómetro, haga clic en Parámetros y seleccione todos los canales (por ejemplo, PE, APC, etc.) utilizados en el panel de tinción, incluidos los parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC).
- Seleccione la escala lineal como parámetro de Hoechst desmarcando la escala logarítmica y verifique el ancho (W) del pulso de voltaje para FCS, SSC y Hoechst.
nota: Todos los parámetros se muestran de forma predeterminada en escala logarítmica (log), excepto FSC y SSC que están en escala lineal. Todos los parámetros se analizan mediante el área (A) y la altura (H) del pulso de voltaje.
- En la hoja de cálculo global, cree un diagrama de puntos con FSC-A en el eje x y SSC-A en el eje y.
- Ejecute la muestra de bazo sin teñir haciendo clic en Adquirir datos en el Panel de adquisición.
- Establezca la configuración adecuada de FSC y SSC para visualizar las celdas modificando los valores de voltaje en la sección Parámetros, y cree una puerta para seleccionar todas las celdas que se muestran en el diagrama de puntos FSC-A/SSC-A haciendo clic en Puerta de polígono en la barra de herramientas del espacio de trabajo de la Hoja de cálculo global.
- Visualice las celdas controladas en histogramas con cada parámetro de fluorescencia en el eje x.
- Ejecute muestras de bazo sin teñir y completamente teñidas para ajustar el detector de fluorescencia (PMT) para tener una separación clara entre las señales negativas y positivas de las células teñidas para cada parámetro de fluorescencia.
- Para realizar la configuración de compensación, haga clic en Experimento en la cinta del área de trabajo y, en la sección Configuración de compensación, seleccione Crear controles de compensación. Desmarque Incluir tubo/pozo de control sin manchar y haga clic en OK
nota: Esta operación dará como resultado la creación de un espécimen denominado Controles de compensación y una hoja de cálculo normal que contiene varias hojas correspondientes a cada parámetro seleccionado.
- Ejecute una muestra de perlas de compensación (consulte la sección 6); establezca los ajustes FSC y SSC apropiados para visualizar las perlas modificando los valores de voltaje y el umbral de adquisición de 5.000 en los parámetros FSC en la ventana del citómetro.
- Ajuste la puerta P1 en la población de cuentas y verifique que los picos positivos y negativos sean visibles en el eje x. Repita esta operación para cada muestra de cordón de compensación y, por último, registre cada archivo de muestra haciendo clic en Registrar datos en el panel de adquisición (registre al menos 5.000 eventos para cada muestra).
- Para cada muestra de perla registrada, establezca las puertas P2 y P3 en los picos positivo y negativo, respectivamente.
- Ejecute las muestras de celda para la compensación (consulte los pasos 4.2 y 4.4.7, y las secciones 5 y 6). Modifique los voltajes FSC y SSC y el valor umbral para visualizar las celdas, ajuste la puerta P1 y, finalmente, registre cada archivo de muestra (registre al menos 10,000 eventos). Coloque las puertas P2 y P3 en los picos positivo y negativo, respectivamente.
nota: Para la compensación del canal de Hoechst, utilice el G0/G1 como pico negativo (P3) y el G2/M como el positivo (P2).
- Haga clic en Experimento en la sección de la cinta del área de trabajo y, en la sección Configuración de compensación, seleccione Calcular compensación.
- Asigne un nombre a la configuración de compensación creada, vínlela y guárdela en el experimento actual.
- Adquisición de muestras experimentales
- Abra un espécimen haciendo clic en Nuevo espécimen en la barra de herramientas del navegador y cree la estrategia de compuerta en la Hoja de cálculo global.
nota: La estrategia de compuerta de la adquisición de muestras es similar a la del análisis de muestras, descrita en la Figura 2 y la Sección 9.
- Mostrar todas las poblaciones de eventos en un histograma con CD3-A en el eje x. Cree una puerta de intervalo para seleccionar solo las celdas CD3+.
- En el panel de adquisición, seleccione la puerta de almacenamiento como Todos los eventos para las muestras de LN y Todos los eventos o celdas CD3+ para las muestras de bazo.
- Ejecute las muestras experimentales a baja velocidad y, finalmente, registre todos los archivos, asegurándose de recolectar al menos 100-200 células T CD8 específicas de antígeno para cada muestra de los ratones vacunados><.
nota: El tamaño del archivo de las muestras experimentales suele ser grande (30-120 MB), especialmente cuando la frecuencia de células T CD8 específicas del antígeno es baja. Por lo tanto, se debe recolectar un gran número de eventos (> 1 × 106) para registrar al menos 100-200 células T CD8 específicas de antígeno. Los archivos grandes pueden ralentizar el proceso de análisis de datos posterior. La adquisición de solo células CD3+ en muestras de bazo (consulte el paso 8.2.2 anterior) es útil para mantener el tamaño del archivo más pequeño.
- Ejecute y registre el control positivo para el análisis del ciclo celular, es decir, la muestra de BM de ratones no tratados.
>9. Análisis de datos
- Abra el software (ver Tabla de Materiales) y cree diferentes grupos correspondientes a los diferentes órganos a analizar haciendo clic en Crear Grupo en la sección de la cinta del espacio de trabajo (es decir, crear grupo "a-LNs"; "b-spleen"; "c-BM").
nota: Los grupos recién creados aparecerán en la lista de grupos, mientras que el grupo "Compensación" es generado automáticamente por el software.
- Abra la ventana Modificar grupo haciendo doble clic en el nombre del grupo y compruebe que los grupos recién creados están sincronizados. De lo contrario, inserte una marca de verificación en la función Sincronizado.
- Arrastre cada archivo .fcs en su grupo correspondiente.
- Cree la estrategia de compuerta a partir del grupo "a-LNs".
- Haga doble clic en la muestra completamente teñida en el grupo para abrir la ventana del gráfico; los ejes x e y están etiquetados como en los archivos fcs (consulte la configuración del citómetro de flujo, Tabla 2).
- Muestre el total de eventos adquiridos para esta muestra en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y DNA-W en el eje y.
- Seleccione solo la población de celdas individuales haciendo clic en Rectángulo en la sección de la herramienta de compuerta de la ventana del gráfico.
nota: Las células individuales tienen los siguientes valores de ADN-A: 2N (bajo): entre 2N y 4N (intermedio), o igual a 4N (alto), mientras que los valores de ADN-W son idénticos para todas ellas (paso 1 de la Figura 2).
- Haga doble clic en el centro de la puerta rectangular para mostrar celdas individuales en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el tinte de celda muerta en el eje y.
- Seleccione solo la población de celdas vivas haciendo clic en Polígono en la sección de la herramienta de compuerta de la ventana del gráfico. Las células vivas son negativas para el colorante de células muertas (paso 2 de la Figura 2).
- Haga doble clic en el centro de la puerta poligonal para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el parámetro SSC-A en el eje y.
- Haga clic en Rectángulo y cree una puerta "relajada" para incluir todas las celdas vivas individuales en ese gráfico (paso 3 de la Figura 2).
- Haga doble clic en el centro de la puerta "relajada" para mostrar las celdas en un gráfico de puntos con CD3 en el eje x y CD8 en el eje y.
- Seleccione las celdas CD3+CD8+ haciendo clic en Polígono (paso 4 de la Figura 2).
- Haga doble clic en el centro de la puerta CD3+CD8+ para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con Tetr-gag en el eje x y Pent-gag en el eje y.
- Seleccione las células T CD8 específicas del antígeno (positivas tanto para Tetr-gag como para Pent-gag) haciendo clic en Polígono (paso 5 de la Figura 2).
- Haga doble clic en el centro de la puerta específica de gag para mostrar las celdas en un gráfico de puntos con DNA-A en el eje x y Ki67 en el eje y (Figura 3).
- Seleccione las celdas en las diferentes fases del ciclo celular haciendo clic en Quad en la sección de la herramienta de compuerta de la ventana del gráfico.
nota: Las células en la fase G0 son células bajas de ADN Ki67neg (cuadrante inferior izquierdo); las células de G1 son Ki67pos-DNA bajo (cuadrante superior izquierdo); las células en S-G2/M son Ki67pos-DNA intermedio/alto (cuadrante superior derecho) (Figura 3).
- Copie la estrategia de compuerta creada en una muestra en el grupo correspondiente para aplicar las puertas a todas las muestras del grupo.
- Repita los pasos 9.5 a 9.18 para el "grupo a-LN".
- Compruebe que todas las compuertas son apropiadas para cada muestra del grupo "bazo". Para analizar el ciclo celular entre las células BM (control positivo), haga clic en el centro de la puerta "relajada" para mostrar las células en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y Ki67 en el eje y.
- Verifique que todas las puertas sean apropiadas para cada muestra de los 3 grupos (es decir, para células de bazo, LN y BM).
nota: La puerta de población de una sola célula (paso 9.7) y la puerta cuádruple para el ciclo celular (paso 9.17) pueden tener diferentes coordenadas de puerta en diferentes muestras, principalmente debido a las posibles ligeras diferencias de la intensidad del colorante de Hoechst entre las muestras (sección 6.2). Por esta razón, podría ser necesario modificar la puerta de población de una sola célula y las puertas cuádruples para el ciclo celular en cada muestra. Esto se hará de la siguiente manera: haga doble clic en el nombre del grupo y elimine la sincronización de las propiedades del grupo. Esta operación permite la modificación de las puertas en una muestra sin modificar las mismas puertas en todas las demás muestras del grupo. Después de la eliminación de la sincronización, modifique las puertas cuando sea necesario.
- Para visualizar los resultados obtenidos por este análisis, haga clic en Editor de diseño en la sección de la cinta del espacio de trabajo para abrirlo. Arrastre cada puerta de la estrategia de compuerta en el panel de muestra al editor de diseño y coloque los trazados de acuerdo con la secuencia de la estrategia de compuerta. Si es necesario, cambie el tipo de gráfico haciendo doble clic en el gráfico correspondiente en el diseño y seleccionando el tipo apropiado en la ventana Definición de gráfico.
- Haga clic en Agrupar e iterar por funciones en la cinta de diseño para visualizar los resultados obtenidos en cada órgano y comparar diferentes muestras.
Tabla 1: Ajustes del citómetro de flujo.
| muestra | Panel de anticuerpos | | | | | | |
| Manchado completo | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
| Ki67 FMO | | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
| Tetr-gag APC FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
| Pent-gag PE FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | |
| CD8 FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | | PE con mordaza pendida |
| CD3 FMO | Ki67 FITC | | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
| Tinte de viabilidad fijable FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
| Hoechst 33342 FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | | CD8 BUV805 | PE con mordaza pendida |
Tabla 2: Ajustes del citómetro de flujo.
| instrumento | BD LSR Fortessa |
| láser | Azul 488nm | Rojo 639nm | UV 355nm | Amarillo/verde 561nm |
| Filtros de paso de banda | 530/30 | 710/50 | 670/14 | 780/60 | 530/30 | 820/60 | 585/15 | 780/60 |
| Filtros de paso largo | 505LP | 685LP | | 750LP | 505LP | 770LP | | 750LP |
| Fluorocromos/Colorantes utilizados | FITC | PERCPCY5.5 | Apc | eFluor 780 | Hoechst 33342 | BUV805 | pei | PECY7 |
| Nombre correspondiente en archivos fcs | Alexa Fluor 488 | PERCPCY5.5 | Apc | APC-H7 | Hoechst-Rojo | BUV737 | pei | PECY7 |
