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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de materiales para inyección
- Esterilizar una aguja y una jeringa de 33 G: desmontar y esterilizar en autoclave a 115 οC. Preparar las agujas para la inyección levándolas en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Descongele las partículas marcadas con fluorescencia a temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Prepare la solución inyectable reconstituyéndola en una solución de 50 mg/ml en PBS estéril con iones de calcio e iones de magnesio (Ca2+/Mg2+).
nota: En este protocolo se utilizan partículas de origen fúngico marcadas con AF488 que han sido validadas para ensayos de fagocitosis. Para una absorción óptima, prepare las partículas frescas e inmediatamente antes de la inyección.
NOTA 2: Las concentraciones de partículas pueden optimizarse para cada experimento específico.
>2. Inyección intravítrea de solución de perlas
NOTA: Se requieren dos personas para realizar la inyección, de tal manera que la persona que realiza la inyección pueda sostener el ratón y mantener el enfoque en el globo ocular, mientras que la otra persona pasa la jeringa cargada y empuja el émbolo.
- Anestesiar al roedor mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/ml de ketamina y 10 mg/ml de xilacina a una dosis de 20 μl/10 g de peso corporal. Antes de la inyección, use un pellizco en el dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia.
nota: El isoflurano tiene un profundo efecto sobre la función de las células mieloides, por lo tanto, debe evitarse su uso a lo largo de este ensayo.
- Cargue la aguja con 0,5 μl de solución de partículas marcadas con fluorescencia.
- Coloque al ratón de lado bajo un microscopio quirúrgico (Figura 1A-B). Utilice un material suave, por ejemplo, un paquete de gel, para un mejor posicionamiento del ratón. Para ratones jóvenes en los que los ojos aún no están abiertos, abra suavemente los párpados con la ayuda de pinzas finas en ángulo de 45o creando una fisura a lo largo de la ranura desde la cual los párpados eventualmente se abrirán.
- Con la ayuda de pinzas finas en ángulo de45º, aplique presión cuidadosamente alrededor del párpado, de modo que el globo ocular sobresalga ligeramente de la cuenca. Sostenga la cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por la mandíbula y estire suavemente la piel en paralelo a los párpados para mantener el ojo ligeramente fuera de la cuenca. Tenga cuidado de no agarrar demasiado cerca de la garganta (Figura 1B).
- Para perforar el globo ocular, inserte la aguja de la jeringa en el limbo corneal (donde se conectan la córnea y la esclerótica). Esto es visible como un círculo gris en ratones pigmentados. Retraiga ligeramente la aguja para expulsar un pequeño volumen de líquido vítreo y luego inyecte. La persona que realiza la inyección debe sujetar suavemente el ratón con una mano y la aguja con la otra; La segunda persona debe empujar lentamente el émbolo.
- Retraiga la jeringa lentamente. Aplica gotas humectantes para mantener el ojo hidratado.
- Deje que el roedor se recupere en una jaula sobre una almohadilla térmica y continúe monitoreando al animal. Si trabaja con cachorros, no regrese al animal a una jaula con otros animales alerta hasta que esté respirando y sea capaz de moverse espontáneamente. Si trabaja con adultos, no devuelva al roedor a una jaula con otros animales alerta hasta que recupere la decúbito esternal.
>3. Recolección de tejido de la retina
NOTA: El tejido de la retina de los ojos que no se inyectan con partículas marcadas con fluorescencia debe recogerse como control para el análisis de citometría de flujo. Aunque el ensayo se puede realizar con una sola retina, para obtener el mejor rendimiento, se deben agrupar dos retinas.
- Recoja tejido de la retina 3 horas después de la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia.
nota: Si bien el tiempo después de la inyección de la solución de partículas puede optimizarse para cada experimento específico, encontramos que 3 horas después de la inyección, se pudo ver la absorción de partículas en la mayoría de las capas de la retina (Figura 1C-D).
- Sacrificar ratones por luxación cervical.
- Recoja los globos oculares presionando suavemente contra el párpado con la ayuda de pinzas finas en ángulo de45º para apoyar el globo ocular. Coloque las pinzas detrás del globo ocular y tire de ellas.
- Diseccionar la retina con un microscopio de disección. Transfiera el globo ocular a una placa de Petri que contenga una pequeña cantidad de PBS con Ca2+/Mg2+. En un área seca de la placa de Petri, perfore el globo ocular en el limbo corneal con la punta de unas pinzas superfinas.
- Sostenga el globo ocular con la ayuda de pinzas finas en ángulo de 45o y use unas tijeras de resorte para cortar alrededor del limbo corneal, hasta que se corte aproximadamente la mitad de la circunferencia del limbo corneal.
- Sujete el globo ocular con las pinzas en ángulo fino de 45º y lleve elglobo ocular al PBS. Con un segundo par de pinzas finas en ángulo de45º, desgarre la córnea y la esclerótica. El cristalino y la retina saldrán intactos.
- Separe el cristalino y la retina. Recoja la retina y transfiérala a un tubo de ensayo de poliestireno de 5,4 ml que contenga 2 ml de PBS con Ca2+/Mg2+.
>4. Preparación de una suspensión de una sola célula
- Prepare suspensiones unicelulares utilizando un kit de disociación de tejido neuronal con pequeñas modificaciones en las instrucciones del fabricante. Brevemente, triturar las retinas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 y realizando una digestión enzimática a 37 oC sin agitar.
>5. Tinción de suspensiones unicelulares para análisis citométrico de flujo
- Vuelva a suspender las células en 200 μl de tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con 0,2 % de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,09 % de azida sódica) y transfiéralas a una placa de 96 pocillos con fondo en U. Centrífuga durante 5 min a 130 x g.
nota: La azida de sodio es dañina para los seres humanos y el medio ambiente. Utilice el equipo de protección personal adecuado y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales.
- Invierta el plato sobre un fregadero para desechar el sobrenadante. Para bloquear los receptores Fc, resuspenda las células en 25 μl de tampón de tinción que contenga 5 μg/ml de anticuerpo anti-ratón CD16/CD32 por pocillo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 25 μl de tampón de tinción que contenga 0,5 μg/ml de anti-ratón Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml de anti-ratón Ly6G-Pe-Cy7 y 2,5 μg/ml de anti-ratón CD11b-BV650. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Invierta la placa para desechar el sobrenadante. Lavar resuspendiendo las células en 200 μl de tampón de tinción.
- Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Volver a suspender en 200 μl de tampón antimanchas que contiene 0,5 μg/ml de yoduro de propidio (PI). Transfiera a tubos de microtitulación de 1,2 ml.
- Lave los pocillos con 100 μl adicionales de tampón de tinción que contenga 0,5 μg/ml de PI y agrupe los 200 μl anteriores en los tubos de microtitulación de 1,2 ml. Se obtiene un volumen total de 300 μl de células teñidas.
>6. Análisis de citometría de flujo
- Con un láser convencional de tres (violeta, azul y rojo), evite los tintes PE, PerCP-Cy5.5, BV510 y PI debido al derrame significativo de las partículas fluorescentes AF488 extremadamente brillantes. Utilice un cuarto láser (amarillo) para optimizar este ensayo, ya que permite el uso de anticuerpos marcados con PE y PI (en el canal mCherry en lugar del canal PerCP-Cy5.5) (Figura 2).
nota: Si no dispone de un láser amarillo, utilice un tinte de exclusión de células muertas en otro canal.
- Puerta en las células PI negativas (PI-) para excluir las células muertas (Figura 2B).
- Después de excluir las células muertas, se pueden seleccionar las células CD11b positivas (CD11b+), lo que incluirá a todas las células mieloides (Figura 2C).
- Dentro de la población CD11b+, se puede utilizar Ly6C-/Ly6G- para excluir neutrófilos (CD11b+/Ly6G+) y monocitos (CD11b+/Ly6C+; Figura 2D). Después de la activación de la microglía (aquí definida como CD11b+/Ly6C-/Ly6G- para simplificar), deben ser visibles dos poblaciones claras; uno negativo y otro positivo para las partículas marcadas con fluorescencia. Las células fagocíticas habrán absorbido partículas y, por lo tanto, son AF488+ (Figura 2E).
nota: Las poblaciones positivas para Ly6C o Ly6G también se pueden analizar para medir la absorción de partículas utilizando este enfoque de tinción. El porcentaje de células fagocíticas CD11b+ se correlaciona bien con el porcentaje de microglía fagocítica (Figura 2F). Para los investigadores sin experiencia en citometría de flujo, se puede realizar un análisis más simple con tinción de CD11b sola, aunque esto incluirá neutrófilos y monocitos fagocíticos, así como microglía. Dentro de esta población de CD11b+/Ly6C-/Ly6G-, estas células tienen > 99% de microglía según se juzga mediante tinción con los marcadores F4/80 y CX3CR1; Estos rotuladores se pueden añadir pero no son necesarios en nuestras manos.
