Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

NOTA: Este protocolo ha sido probado en células de sangre periférica aisladas frescas o congeladas y sangre entera.

1. Tinción celular

NOTA: Es importante elegir pares de fluorocromos prácticamente sin superposición espectral para reducir la dispersión de datos debido al alto desbordamiento de un fluorocromo en el otro detector de fluorocromo. Para lograr una identificación óptima de todos los subconjuntos de células, se deben utilizar fluorocromos con un alto rendimiento cuántico, como los pares de anticuerpos PE-BV421 y PE-APC.

1. Tinción de PBMC frescos y congelados
   1. Transfiera 100 μL de PBMC (1 x 10⁶ celdas) a una placa inferior en V de 96 pocillos.
      nota: Se puede utilizar cualquier número de celdas inferior a 1 x 10⁶ con resultados similares.
   2. Centrifugar a 350 x g durante 3 min a RT y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. Añadir a cada pocillo 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga un colorante fijable vivo/muerto que reaccione con la amina libre sobre las proteínas durante 10 minutos para etiquetar las células muertas.
   3. Prepare para cada muestra 30 μL de una mezcla que contenga todos los anticuerpos (anti-CD3. -CD56, TCRγδ en el fluorocromo A y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en el fluorocromo B). Las concentraciones de anticuerpos se indican en la Tabla 1 y en la Tabla 2. En esta etapa, también se pueden agregar anticuerpos titulados contra diferentes moléculas diana y en diferentes fluorocromos (p. ej., Tabla 3).
      nota: La concentración de anticuerpos puede variar según el fabricante y el número de lote. Por lo tanto, se deben realizar pruebas preliminares para lograr la señal óptima. Se utilizaron PBS, PBS/albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%, PBS/azida sódica al 0,2% o PBS/BSA al 0,5%/azida sódica al 0,1% con resultados similares para diluir los anticuerpos. Las células también se pueden teñir en volúmenes diferentes a 30 μL para integrar fácilmente esta metodología en los protocolos de tinción ya existentes.
   4. Centrifugar a 350 x g durante 3 min a RT y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. Agregue el cóctel de anticuerpos a cada pocillo y vuelva a suspender con cuidado sin generar burbujas. Incubar durante 30 min en RT en la oscuridad.
      nota: Es posible teñir las muestras a 4 °C con resultados similares.
   5. Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugar a 350 x g durante 3 min a RT y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. Vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS y adquiera datos en un citómetro de flujo. Si se modifican los volúmenes de tinción, asegúrese de diluir al menos 20 veces la mezcla de anticuerpos original utilizada para lavar el exceso de anticuerpo>nota: Las células teñidas pueden fijarse dentro de PBS/2% de paraformaldehído, mantenerse en un refrigerador a 4 °C durante la noche y luego adquirirse en un citómetro de flujo al día siguiente.
      cautela: El paraformaldehído es dañino si se ingiere y puede causar irritación de la piel

>2. Titulación de anticuerpos

NOTA: La titulación de anticuerpos es el paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad. La valoración de γδ anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 y -TCR sigue el procedimiento estándar mediante el cual la concentración de anticuerpos para separar de forma óptima los picos positivos y negativos se deriva mediante el índice de tinción máximo. Se deben seleccionar diluciones en el pico o más cerca del pico en el lado ascendente de la curva del índice de tinción (Figura 1A-C). El anticuerpo anti-CD4 se titula para situar el pico de la población CD4 positiva entre las poblaciones CD3 monopositivas y los linfocitos T CD3⁺/CD8⁺, más cerca de la señal CD3 monopositivo para discriminar mejor las poblaciones CD8dim (linfocitos T CD8⁺ γδ y linfocitos T NK). En la misma línea, la titulación de CD56 tiene como objetivo posicionar las células NK CD56⁺ entre la población CD3⁺ y CD3^-.

1. Curva máxima de índice de mancha
   NOTA: La valoración de γδ anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 y -TCR sigue el procedimiento estándar mediante el cual la concentración de anticuerpos para separar de manera óptima los picos positivos y negativos se deriva mediante una curva de índice de tinción máxima. Si se añaden anticuerpos contra otros marcadores al panel, también es necesario valorarlos con una curva de índice de tinción máxima.
   1. Prepare una dilución de anticuerpos de 2 veces llenando 10 pocillos de una placa de 96 pocillos con 40 μL de tampón de tinción. En el primer pocillo, aumente el volumen final a 80 μL de tampón de tinción y agregue el anticuerpo de interés a una concentración 4 veces superior a la concentración sugerida por el fabricante.
   2. Mezclar bien y transferir 40 μL al segundo pocillo. Mezcle bien y repita este paso para todos los demás pocillos.
   3. Teñir 10 muestras de PBMC o sangre entera con 30 μL de las 10 diluciones diferentes de anticuerpos de 2 veces siguiendo el protocolo descrito anteriormente.
   4. Adquiera datos con un citómetro de flujo y trace la señal de cada dilución (Figura 1A).
   5. Controlar las poblaciones negativas y positivas para cada concentración de anticuerpos. El aumento de la concentración de anticuerpos puede conducir a un fondo más alto. Por lo tanto, cambie el tamaño de la puerta negativa en consecuencia.
   6. Para cada concentración de anticuerpos, extraiga información sobre la mediana y la desviación estándar de la intensidad fluorescente de la población negativa, y la mediana de la intensidad fluorescente de la población positiva. Calcule para cada concentración de anticuerpos el índice de tinción con esta fórmula: (mediana de la intensidad fluorescente de la población positiva — mediana de la intensidad fluorescente de la población negativa) ÷ (2 x desviación estándar de la intensidad fluorescente de la población negativa) (Figura 1B).
   7. Trace el índice de tinción frente a la concentración de anticuerpos expresada como una fracción de la dilución del anticuerpo (p. ej., dilución 1:10 = 0,1) e identifique la concentración del anticuerpo con el valor máximo del índice de tinción (Figura 1C).
2. Titulación de anticuerpos anti-CD4 y -CD56
   NOTA: La valoración de anticuerpos anti-CD4 y -CD56 se basa en la valoración previa de los otros marcadores en el panel de dos fluorocromos. En el caso del anticuerpo anti-CD4, la valoración tiene como objetivo situar la señal anti-CD4 entre la señal doble CD8⁺/CD3⁺ y la población positiva única de CD3 (Figura 1D).
   1. Valore los anticuerpos anti-CD4 y CD56 con una estrategia de dilución de 2 veces como se describió anteriormente, agregando concentraciones adicionales en el medio para identificar con precisión el rango de concentración que permite separar las células T CD4⁺ y las células NK de las otras poblaciones de células.
   2. Valore el anticuerpo anti-CD4 colocando la señal anti-CD4 entre la señal doble CD8⁺/CD3⁺ y la población positiva única de CD3 (Figura 1D).
      nota: Se debe tener especial cuidado para separar claramente las células T CD4⁺ de las poblaciones diminutos CD8⁺.
   3. Titule el anticuerpo anti-CD56 siguiendo una estrategia similar a la titulación de anticuerpos anti-CD4, colocando células NK entre las poblaciones CD3 negativas y CD3 positivas.

>3. Estrategia de compuerta

1. Identifique las poblaciones de células linfocíticas y monocíticas y elimine las células muertas y la mayoría de los glóbulos rojos residuales del análisis.
   1. Seleccione toda la población que contiene linfocitos y monocitos en función del área de dispersión frontal frente a lateral (FSC-A frente a SSC-A). Elimine los agregados de celdas del análisis a través de la altura de dispersión directa frente a la anchura de dispersión directa (FSC-H frente a FSC-W) y la altura de dispersión lateral frente a la anchura de dispersión lateral (SSC-H frente a SSC-W).
   2. Utilice un marcador de discriminación de vivos/muertos para excluir del análisis los glóbulos muertos positivos brillantes y los glóbulos rojos residuales. Puerta sobre linfocitos y monocitos en base a los diferentes perfiles FSC-A y SSC-A.
2. Estrategia de activación de siete marcadores de siete marcadores de dos fluorocromos de las poblaciones linfocíticas.
   nota: Dentro del subgrupo CD3 positivo, las células T CD4⁺, CD8⁺ y γδ se pueden separar utilizando anticuerpos que se dirigen únicamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera comparable, dentro del subgrupo CD3 negativo, las células B, las células NK y los monocitos se pueden identificar de forma única utilizando anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente.
   1. Seleccione la puerta de linfocitos y cree un diagrama de puntos con en cada eje uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo (Figura 2B).
   2. Puerta en linfocitos T CD8⁺ identificados como linfocitos CD3⁺/CD8⁺ doble positivo en la esquina superior derecha del diagrama de puntos (Figura 2B). Excluya la tenue población de CD8 que podría contener células NKT. Puerta en linfocitos T CD4⁺ identificados como población entre linfocitos T CD8⁺ y las poblaciones CD3 únicas positivas. Puerta en linfocitos T γδ identificados como linfocitos CD3 altos. Las subdivisiones de los linfocitos T γδ son CD8 positivos y CD8 negativos.
   3. Puerta en las células NK identificada como la población entre las células CD3 positivas y las células CD3 negativas. Subdivida las células NK en CD8 positivo y CD8 negativo. Puerta de las células B identificada como población CD3-negativa CD19⁺ en la esquina inferior derecha del diagrama de puntos.
   4. Seleccione las puertas de monocitos y cree un diagrama de puntos con en cada eje uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo (Figura 2C). Puerta a la población CD3^-/CD14⁺.

Tabla 1: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de dos células inmunitarias de fluorocromo de PBMC (combinación BV421-PE).

Tabla 2: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de células inmunitarias de dos fluorocromos de PBMC (APC-PE combinación).

Tabla 3: Panel de anticuerpos utilizado para teñir PBMC congelado de un paciente con mieloma múltiple.

Figura 1: Titulación representativa de anticuerpos. (A) El diagrama de puntos muestra la expresión de CD8 en PBMC fresco teñido con la concentración indicada del anticuerpo. (B) La tabla representa la mediana y la desviación estándar de la intensidad fluorescente de la población CD8+, la mediana de la intensidad fluorescente CD8- y el índice de tinción derivado para cada concentración probada. (C) El gráfico muestra cómo derivar la concentración óptima del anticuerpo en función del índice de tinción. (D) Titulación representativa del anticuerpo CD4. El panel D ha sido modificado de Boin et al. 2017

Figura 2: Estrategia representativa de compuertas y resultados de la discriminación por subpoblaciones. (A) Representación esquemática de la exclusión de dobletes, la discriminación de células vivas y la activación de linfocitos y monocitos basada en el tamaño. (B) Subpoblaciones de linfocitos identificadas con el enfoque de dos fluorocromos. (C) Monocitos identificados con el enfoque de dos fluorocromos. La cifra ha sido modificada con respecto a Boin et al. 2017