Uso de sondas de tensión basadas en ADN para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias

Resumen

Fuente: Ma, R. et al., Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de Piconewton por las células inmunitarias. J. Vis. Exp.(2021)

El video muestra un método para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias utilizando nanopartículas de oro ancladas en polietilenglicol y sondas de tensión de horquilla de ADN. Las interacciones de los linfocitos T CD8 positivos desencadenan el despliegue de la sonda, emitiendo fluorescencia, mientras que las hebras de bloqueo mantienen la señal para cuantificar las fuerzas aplicadas por las células inmunitarias.

Protocolo

1. Preparación de oligonucleótidos

1. Disuelva el ácido desoxirribonucleico (ADN) de la cadena de ligandos en agua (resistividad de 18,2 MΩ, utilizada en todo el protocolo). Agite y centrifuga la solución con una centrífuga de mesa. Ajuste el volumen de agua de manera que la concentración final sea de 1 mM. Validar la concentración mediante el uso de un espectrofotómetro de nanogotas para medir la absorbancia a 260 nm y determinar la concentración final en función del coeficiente de extinción del oligonucleótido.
   nota: La hebra del ligando tiene una modificación en cada extremo, amina 5' y biotina 3', para conjugarse con el fluoróforo y presentar el ligando biotinilado. El grupo amina en la hebra del ligando debe conjugarse con un fluoróforo. El colorante Cy3B se utiliza para esta conjugación debido a su alto brillo y fotoestabilidad, pero generalmente no se ofrece comercialmente y requiere conjugación interna. En consecuencia, en la siguiente sección se describe la conjugación entre las aminas y los colorantes éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). Para los usuarios finales que no tienen acceso a instalaciones o recursos para la modificación de ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados se pueden comprar a proveedores de síntesis de ADN personalizados que ofrecen tintes brillantes y fotoestables, como la familia de tintes Alexa y Atto.
2. Prepare 10 soluciones salinas tamponadas con fosfato (PBS) y bicarbonato de sodio (NaHCO₃) 1 M. Mezcle 10 μL de la solución de hebra de ligando de amina 1 mM (10 nmol) con 10 μL de PBS 10x, 10 μL de NaHCO₃ 1 M y 60 μL de_H2O. Disuelva 50 μg de N-hidroxisuccinimida Cy3B (éster NHS) en 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) inmediatamente antes de usar y agregue a la mezcla para obtener un volumen total de reacción de 100 μL. Agregue el éster Cy3B NHS último. Deje reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h o 4 °C durante la noche.
3. Prepare la hebra de bloqueo Atto647N conjugando la hebra de bloqueo de amina con el éster Atto647N NHS. Prepare 10 soluciones de PBS y 1 M de NaHCO₃. Mezcle 10 μL de la solución de hebra de bloqueo de amina de 1 mM (10 nmol) con 10 μL de PBS 10x, 10 μL de NaHCO₃ 1 M y 60 μL de_H2O. Disuelva 50 μg de éster Atto647N NHS en 10 μL de DMSO inmediatamente antes de usar y agregue a la mezcla hasta obtener un volumen de reacción total de 100 μL. Agregue el éster Atto647N NHS al final. Deje reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h o 4 °C durante la noche.
4. Después de las reacciones, elimine los subproductos, el exceso de colorante y las sales mediante filtración de gel desalinizante P2. Diluir la mezcla de reacción con_H2Ohasta un volumen total de 300 μL, que es apropiado para el siguiente paso de purificación de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Añadir 650 μL de gel P2 hidratado a un dispositivo centrífugo y centrifugar a 18.000 x g durante 1 min. Retire el líquido de la parte inferior del dispositivo, agregue la mezcla de reacción a la columna que contiene gel P2, gire a 18,000 x g durante 1 minuto y recoja la mezcla de reacción en la parte inferior del dispositivo.
   nota: El gel P2 debe hidratarse al menos 4 h antes de su uso con_H2O.
5. Purifique la mezcla de reacción desalinizada con HPLC utilizando una columna C18 designada para la purificación de oligonucleótidos, con disolvente A: acetato de trietilamonio (TEAA) 0,1 M en H2 O y B: acetonitrilo (ACN) como fase móvil para una elución en gradiente lineal 10-100% B durante 50 min a un caudal de 0,5 mL/min. Inyecte la mezcla de reacción desalinizada en HPLC de fase inversa con un circuito de inyección de 500 μL para la purificación. Recoja el producto que tiene un pico de absorbancia para el ácido desoxirribonucleico, ADN (260 nm) y un pico de absorbancia para el fluoróforo (560 nm para Cy3B y 647 nm para Atto647N) y séquelos en un concentrador centrífugo al vacío durante la noche (consulte la Figura 1A).
6. Reconstituya el producto de colorante oligogénico seco en 100 μL de agua. Determine la concentración de la hebra de ligando Cy3B y la hebra de bloqueo Atto647N con el espectrofotómetro de nanogotas. Asegúrese de que la proporción de etiquetado del tinte sea cercana a 1:1. Corrija la absorbancia de 260 nm del colorante si es necesario al determinar la concentración de oligonucleótidos.
7. Valide el producto purificado con espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) utilizando 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) como sustrato en 50% ACN/H,₂O con 0,1% de ácido trifluoracético (TFA) y 5 mg/mL de citrato de amonio utilizando 0,5 μL del producto a 1-5 μM para la preparación de muestras de MALDI-TOF-MS. Un ejemplo de espectro de masas se puede encontrar en la Figura 1B.
8. Disuelva la hebra de horquilla y la hebra de anclaje del enfriador en agua y asegúrese de que la concentración de las soluciones madre esté entre 50 y 100 μM.
   nota: La hebra de horquilla no está modificada y se puede sintetizar directamente a medida de un proveedor. La hebra de anclaje tiene un grupo de anclaje de tiol y un extinguidor BHQ2 y se puede sintetizar directamente de forma personalizada de un proveedor.
9. Alícuota de todos los oligonucleótidos. Para uso y almacenamiento a corto plazo, almacene estos oligonucleótidos a 4 °C. Para un almacenamiento a largo plazo, congélelos y manténgalos a -20 °C. En este punto, todos los oligonucleótidos están listos para el ensamblaje de la sonda de tensión de ADN.
   nota: Los ciclos repetidos de congelación-descongelación no son problemáticos para los oligonucleótidos.

2. Preparación de la superficie

NOTA: La preparación de los sustratos de la sonda de tensión de horquilla de ADN tarda dos días. La sonda de tensión de horquilla de ADN se funcionalizará en cubreobjetos de vidrio.

1. Día 1
   1. Coloque los cubreobjetos de 25 mm en una gradilla de politetrafluoroetileno en un vaso de precipitados de 50 ml. Cada estante puede contener hasta 8 cubreobjetos. Enjuague los cubreobjetos sumergiéndolos en agua tres veces.
   2. Añada 40 ml de una solución de etanol mezclado con agua en una proporción 1:1 (v:v) al vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos, y selle el vaso de precipitados con una película de parafina.
   3. Sonicar el vaso de precipitados durante 15 min en un limpiador ultrasónico (frecuencia de funcionamiento de 35 KHz) para limpiar los cubreobjetos. Después de la sonicación, deseche el líquido y enjuague el vaso de precipitados con agua con la rejilla y los cubreobjetos al menos 6 veces para eliminar cualquier disolvente orgánico restante.
   4. Prepare la solución fresca de Piraña mezclando ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3:1. Para hacer 40 mL de solución de Piraña, agregue primero 30 mL de ácido sulfúrico a un vaso limpio de 50 mL y luego agregue lentamente 10 mL de peróxido de hidrógeno, H₂O₂. La solución de piraña se calentará y burbujeará rápidamente con la adición del H₂O₂. Mezcle suavemente la piraña con el extremo de una pipeta de vidrio.
   5. A continuación, transfiera la rejilla que contiene los cubreobjetos al vaso de precipitados que contiene una solución de Piraña suavemente mezclada para grabar (Figura 2A). Deje que la solución de piraña se hidroxile y limpie los cubreobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del grabado de Piraña, transfiera la rejilla con pinzas de acero o politetrafluoroetileno a un vaso de precipitados limpio de 50 ml con agua y enjuague nuevamente con agua al menos 6 veces.
      cautela: Grandes cantidades de sustancias orgánicas podrían reaccionar vigorosamente con la solución de piraña y causar una explosión. Tenga cuidado y trabaje siempre con la solución de piraña en una campana extractora. Asegúrese de usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Nunca almacene la solución fresca de Piraña en un recipiente sellado.
      nota: La proporción de peróxido de hidrógeno a ácido sulfúrico debe mantenerse por debajo de 1:2 (v:v) y nunca debe exceder 1:1. Al sumergir la rejilla con cubreobjetos en solución de piraña, colóquelos en la solución lentamente y con cuidado. No deseche la solución inmediatamente después del grabado, ya que todavía está activa y caliente. Déjalo en el vaso de precipitados toda la noche antes de verterlo en el contenedor de residuos ácidos.
   6. Sumerja la rejilla que contiene los cubreobjetos en un vaso de precipitados de 50 ml con etanol de 40 ml para eliminar el agua. Deseche el etanol y repita 3 veces para asegurarse de que se haya eliminado el agua.
   7. A continuación, sumerja la gradilla en silano trietoxi aminopropilo al 3% (APTES) (v/v) en 40 mL de etanol para que reaccione con el -OH de los cubreobjetos durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 2B)
      nota: El etanol puede ser reemplazado por acetona.
   8. Enjuague las superficies 6 veces sumergiéndolas en 40 mL de etanol, luego seque en el horno a 80 °C durante 20 min. Después de enfriar, guarde los cubreobjetos secos modificados con amina a -20 °C para su uso futuro (hasta 6 meses).
   9. Cubra la parte inferior interna de las placas de Petri de plástico de 10 cm de diámetro con una película de parafina. La película de parafina evita que los cubreobjetos se deslicen dentro de la placa de Petri y ayuda a mantener la solución para los siguientes pasos de funcionalización en los cubreobjetos. Coloque los cubreobjetos modificados con amina enfriados en las placas de Petri. El lado a funcionalizar debe estar hacia arriba.
   10. Para modificar los grupos amina en los cubreobjetos, agregue 300 μL de poli(etilenglicol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) al 0,5% p/v de ácido lipoico (LA-PEG-SC) y 2,5% p/v mPEG NHS (mPEG-SC) en NaHCO₃ a 0,1 M en cada cubreobjetos e incube durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 2C). Por cada cubreobjetos de 25 mm, pesa 1,5 mg de LA-PEG-SC y 7,5 mg de mPEG-SC. Disuelva los reactivos NHS inmediatamente antes de añadirlos a las superficies, ya que tienen una vida media corta (~10 min) en una solución acuosa a temperatura ambiente. Después de la reacción, enjuague las superficies 3 veces con agua.
       nota: La reacción NHS se puede realizar a 4 °C durante la noche. Los reactivos NHS tienen una vida media más larga antes de la hidrólisis a 4 °C, que es de alrededor de 4-6 h. Esto dará como resultado un procedimiento de preparación de la superficie de tres días.
   11. Añadir 100 μL de bicarbonato de sodio 0,1 M, NaHCO₃ que contenga 1 mg/mL de acetato de sulfo-NHS a un conjunto de cubreobjetos "sándwich" (dos cubreobjetos enfrentados entre sí con tampón de reacción en medio). Permita que se produzca la pasivación durante al menos 30 minutos. Para guardar el reactivo, este paso se podría realizar con 50 μL de 1 mg/mL de acetato de sulfo-NHS. Enjuague con agua tres veces después de la pasivación.
   12. Añadir 0,5 mL de nanopartículas de oro (AuNP, 8,8 nm, ácido tánico, 0,05 mg/mL) a cada cubreobjetos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 2D). Para guardar el reactivo, este paso se puede realizar intercalando también dos cubreobjetos. Asegúrese de que no haya sales en el sistema de los pasos anteriores para evitar la agregación de nanopartículas de oro. No deje que los cubreobjetos se sequen después de este paso.
   13. Mientras tanto, la horquilla de 4,7 pN, la hebra del ligando Cy3B y la hebra de anclaje BHQ2 que forman las sondas de tensión del ADN construyen en una proporción de 1,1:1:1 en cloruro de sodio (NaCl) 1 M a 300 nM en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Recocer las hebras calentando la solución hasta 95 °C durante 5 min, luego enfriar gradualmente disminuyendo la temperatura a 20 °C durante 30 min en un termociclador.
   14. Enjuague los cubreobjetos con agua tres veces después de 30 minutos de incubación con nanopartículas de oro. Añada una hebra de anclaje BHQ2 adicional (de 100 μM de culata) a la solución de ADN recocido para que la relación entre la hebra de anclaje BHQ2 y la hebra del ligando Cy3B sea 10:1. En este punto, la solución de ADN debe contener 300 nM de construcción de sonda de tensión y 2,7 μM de hebra BHQ2. Agregue 100 μL por cada dos cubreobjetos para hacer el "sándwich" (Figura 2E).
   15. Coloque con cuidado una bola de tejido de laboratorio húmeda en la placa de Petri (lejos de los cubreobjetos) y selle la placa con una película de parafina para evitar que la solución se seque. Cubra el plato con papel de aluminio e incube a 4 °C durante la noche.
2. Día 2
   1. Lave el exceso de sondas de los cubreobjetos con 1x PBS. Verifique la calidad de la superficie de la sonda de tensión de ADN bajo un microscopio epifluorescente.
   2. Prepare 40 μg/mL de estreptavidina en 1x PBS e incube en cubreobjetos durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 2F). Por lo general, 100 μL es suficiente para un cubreobjetos de 25 mm. Enjuague con PBS 3 veces después de la incubación para eliminar la cantidad excesiva de estreptavidina.
   3. Prepare 40 μg/mL anticuerpo/ligando biotinilado en 1x PBS. Añadir 50-100 μL por sándwich e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 2G). Enjuague con PBS tres veces después de la incubación para eliminar el exceso de anticuerpo/ligando biotinilado.
   4. Ensamble las cámaras de imagen limpias con las superficies con cuidado. Las superficies pueden agrietarse fácilmente al apretar las cámaras. Añada 0,5-1 mL de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a las cámaras de imagen y manténgalas listas para la obtención de imágenes con células (Figura 2H).

3. Imágenes de las fuerzas del receptor celular

1. Preparar las células inmunitarias de interés en HBSS a 1-2 x 10⁶ células/mL.
   nota: En este trabajo se utilizan como ejemplo las células OT-1 CD8+ naïve. Purifique las células T OT-1 CD8⁺ vírgenes del bazo de ratones sacrificados utilizando el kit de aislamiento de células T CD8⁺ para ratones MACS con un separador de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Aísle y enriquezca las células T CD8⁺ eliminando las células T que no sean CD8+ a las que se une el cóctel de anticuerpos que agotan el magnetismo. Vuelva a suspender las células T vírgenes OT-1 CD8+ purificadas en HBSS a 2 x 10⁶ células/ml y manténgalas en hielo antes de usarlas.
2. Verifique la calidad de la superficie de la sonda de tensión de horquilla de ADN bajo un microscopio de fluorescencia (objetivo 100x) para el control de calidad antes de agregar ligandos o placas de celdas. Obtener imágenes y cuantificar la intensidad media de fondo en el canal Cy3B de la superficie de una sonda de tensión de horquilla de ADN desde al menos 5 posiciones diferentes y 3 réplicas. Mantenga las condiciones de adquisición de imágenes consistentes para que este valor pueda usarse como un marcador confiable de la calidad de la superficie y la densidad de la sonda (Figura 3C).
   nota: Cuantificar el número de hebras de ADN por nanopartícula de oro y el número de nanopartículas de oro por μm² las primeras veces de preparación de la superficie según la literatura, lo que puede utilizarse como otro marcador fiable de la calidad de la superficie.
3. Coloque ~ 4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ células en cada cubreobjetos funcionalizados de la sonda de tensión de ADN y permita que se adhieran y se extiendan durante ~ 15 min a temperatura ambiente.
4. A medida que las células se colocan en las sondas de tensión de la horquilla de ADN y comienzan a propagarse, obtenga imágenes de las señales de fluorescencia que se generan en el canal Cy3B con el objetivo de 100x (Figura 2I).
5. Después de que las células comiencen a producir una señal de tensión en tiempo real en la superficie de la sonda de tensión de horquilla de ADN en el canal Cy3B, adquiera imágenes en los canales Cy3B y Atto647N (la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) proporciona una mejor relación señal-ruido que la epifluorescencia). Posteriormente, agregue la hebra Atto647N a las cámaras de imagen a una concentración final de 200 nM para una hibridación mecánicamente selectiva.
6. Después de 10 minutos de incubación, retire rápida y suavemente el tampón que contiene la hebra de bloqueo fluorescente Atto647N y reemplácelo con sales equilibradas frescas de Hank. Imagen en los canales Cy3B y Atto647N de nuevo y determine el coeficiente de correlación de Pearson con el software Fiji.
7. En el momento de interés para la investigación, introduzca una hebra de bloqueo no fluorescente en las células de la cámara de imágenes para almacenar la señal de tensión. Prepare el material de bloqueo (100 μM) y añádalo a las células hasta una concentración final de 1 μM. Pipetear suavemente para mezclar. La duración del bloqueo puede variar, pero 10 minutos es el tiempo recomendado.
8. Adquiera películas de lapso de tiempo o imágenes de punto final en epifluorescencia para el mapeo de tensión cualitativo y el análisis cuantitativo según sea necesario (Figura 2J y Figura 4).
   nota: Si se desea la medición de la tensión en varios puntos de tiempo, inicie el borrado de las señales de tensión almacenadas mediante la adición de una hebra de desbloqueo. Para evitar el enjuague excesivo, se utiliza una concentración final más alta de la hebra de desbloqueo a 2 μM para iniciar una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por el punto de apoyo con la hebra de bloqueo durante 3 min, lo que borra las señales almacenadas (Figura 2J). Enjuague suavemente el exceso de oligonucleótidos con HBSS. La superficie de la sonda de tensión de la horquilla de ADN y las células están listas para otra ronda de almacenamiento y mapeo de tensión. El desbloqueo de las señales de tensión no es necesario si solo un punto de tiempo es de interés en el estudio.

Resultados

Figura 1: Ejemplos de preparación de oligonucleótidos.(A) Cromatograma de HPLC de purificación de hebras de ligandos Cy3B; (B) Espectros MALDI-TOF-MS del producto; (C) Tabla de la masa calculada y los picos m/z encontrados del material de partida y el oligonucleótido marcado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA)	sigma	56197	Matriz Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	Preparación de superficies
(3-aminopropil)trietoxisilano	Acros	AC430941000	Preparación de superficies
10x Tampón de lisis de glóbulos rojos	Bioleyenda	00-4333-57	búfer
Nanopartículas de oro de 8,8 nm, ácido tánico	Nanocomposix	Pedido personalizado	Preparación de superficies
Atto647N NHS éster	sigma	18373-1MG-F	Fluoróforo, preparación de oligonucleótidos
Cámara de células Attofluor, para microscopía	Thermo Fisher Scientific	A7816	imagenológico
Jeringas BD solo con Luer-Lok	BD biociencia	309657	células
Biotinilado anti-ratón CD3e	ebiociencia	13-0031-82	Anticuerpo/ligando
Ovoalbúmina pMHC biotinilada (SIINFEKL)	Centro central de tetrámeros de los NIH en la Universidad de Emory	Na	Anticuerpo/ligando
Albúmina sérica bovina	sigma	735078001	Bloquear interacciones no específicas
Filtros de células	Biologix	15-1100	células
Coverslip Mini-Rack, teflón	Thermo Fisher Scientific	C14784	Preparación de superficies
Éster Cy3B NHS	GE Cuidado de la Salud	PA63101	Fluoróforo, preparación de oligonucleótidos
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco	Corning	21-031-CM	búfer
etanol	sigma	459836	Preparación de superficies
Sales equilibradas de Hank (HBSS)	sigma	H8264	búfer
Peróxido de hidrógeno	sigma	H1009	Preparación de superficies
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	Preparación de superficies
Kit de inicio Midi MACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-042-301	células
Kit de aislamiento de células T CD8+ para ratones	Miltenyi Biotec	Teléfono 130-104-075	células
Dispositivos centrífugos Nanosep MF	Laboratorio Pall	ODM02C35	Preparación de oligonucleótidos
Nº 2 cubreobjetos de vidrio redondos	VWR	48382-085	Preparación de superficies
NTA-SAM	Dojindo Tecnologías Moleculares	N475-10	Preparación de superficies
Gel P2	Bio-rad	1504118	Preparación de oligonucleótidos
ácido sulfúrico	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	Preparación de superficies
Acetato Sulfo-NHS	Thermo Fisher Scientific	26777	Preparación de superficies
equipo
Columna Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	653950-702		Preparación de oligonucleótidos
Sistema de purificación de agua Barnstead Nanopure	Termo Fisher		Agua
CFI Apo 100× NA 1.49 objetivo	Nikon		microscopia
Cubo Cy5	Chroma		microscopia
Dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones Evolve (EMCCD)	Fotometría		microscopia
Cromatografía líquida de alta resolución	Agilent 1100		Preparación de oligonucleótidos
Fuente de epifluorescencia Intensilight	Nikon		microscopia
Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Preparación de oligonucleótidos
Espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop 2000	Termo Fisher		Preparación de oligonucleótidos
Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti	Nikon		microscopia
Sistema de enfoque perfecto de Nikon	Nikon		microscopia
Software NIS Elements	Nikon		microscopia
Cubo cuádruple banda TIRF 405/488/561/647	Chroma		microscopia
Cubo RICM	Chroma		microscopia
Lanzador TIRF de 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) y 640 nm	coherente		microscopia
Cubo TRITC	Chroma		microscopia
Nombre de Oligo	Modificación de 5' / Modificación de 3'	Secuencia (5' a 3')	uso
Filamento de bloqueo de amina 15mer	5' modificación: sin modificación Modificación de 3': /3AmMO/	AAA AAA GATO TTA TAC CCT ACC TA	Bloqueo de la señal de tensión en tiempo real
Filamento de bloqueo 15mer Atto647N	Modificación de 5': Atto647N Modificación de 3': /3AmMO/	AAA AAA GATO TTA TAC CCT ACC TA	Bloqueo de la señal de tensión en tiempo real
Filamento de bloqueo no fluorescente de 15 meros	5' modificación: sin modificación Modificación de 3': sin modificación	A AAA AAC ATT TAT AC	Bloqueo de la señal de tensión en tiempo real para el análisis cuantitativo
Mechón de horquilla de 4,7 pN	5' modificación: sin modificación Modificación de 3': sin modificación	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCGCACGTAGCC CAGC	Sonda de horquilla
Cadena de ligando de amina	Modificación de 5': /5AmMC6/ Modificación 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda de horquilla
Cordón de anclaje BHQ2	Modificación 5': /5ThiolMC6-D/ Modificación de 3': /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Sonda de horquilla
Filamento de ligando Cy3B	Modificación de 5': Cy3B Modificación 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda de horquilla
Mechón de desbloqueo	5' modificación: sin modificación Modificación de 3': sin modificación	ETIQUETA: GTA, GGG, TAT, AAA, TGT, TTT, TTT C	Desbloqueo de la señal de tensión acumulada