Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de existencias y almacenamiento de CFSE
- Prepare un stock de 5 mM de 5-y 6-carboxifluoresceína diacetato de succinimidil éster (CFSE) en dimetilsulfóxido. Vórtice. Dispense 100 μl de alícuotas en microtubos estériles con tapón de rosca de 0,5 ml. Almacene las alícuotas a -80 °C.
>2. Ratones
- Utilice ratones machos o hembras endogámicos de entre 8 y 12 semanas de edad. Se prefieren los animales del mismo sexo y edad. Asegúrese de que los permisos éticos necesarios para los animales estén en su lugar antes del inicio de los experimentos.
>3. Inmovilización de animales con anestesia con gas isoflurano
- Cargue la unidad de anestesia con isoflurano. Llene la jeringa de vidrio hermético al gas de 10 ml con isoflurano. Evite introducir burbujas de aire. Conecte la jeringa y la entrada de líquido con el tubo suministrado y mueva el empujador hacia adelante hasta que el líquido en el tubo de conexión esté visiblemente a punto de ingresar al vaporizador><.
nota: No guarde el isoflurano en la jeringa cuando no esté en uso.
- Anestesiar a los animales con isoflurano en la cámara de inducción, con un flujo de aire mantenido en aproximadamente 400 - 500 ml/min y la concentración de isoflurano en 3,5%.
nota: La unidad no funcionará sin flujo de aire.
- Una vez que los animales estén dormidos, gire la llave de paso de la unidad de anestesia para dirigir el gas isoflurano a la pieza de la máscara. Compruebe que la pieza de la mascarilla esté intacta para evitar fugas de gas. El flujo de aire se puede mantener a 400 ml/min, alternativamente se puede disminuir a 200 ml/min. Reducir la concentración de isoflurano al 2,6%.
nota: El efecto anestésico puede aumentarse y/o disminuirse ajustando el caudal.
>4. Inyecciones y recuperación de BCG
- Confirmar visualmente y realizar pruebas como la prueba del reflejo de pellizco de los dedos del pie para determinar que los ratones están inmovilizados/dormidos en la pieza de la máscara de isoflurano antes de realizar las inyecciones.
- Inocular en la almohadilla de la pata trasera, 1 x 106 Unidades formadoras de colonias de Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) en 30 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando una jeringa provista de una aguja de 29 G x 1/2 pulg.
nota: La generación de reservas de micobacterias se describe brevemente en la descripción original de este procedimiento, y con gran detalle en otras partes. BCG también está fácilmente disponible en fuentes comerciales. Los autores recomiendan que BCG se someta a una sonicación por pulsos o se pase a través de una jeringa para interrumpir los grumos antes de su inoculación en ratones. El BCG se reitera aquí como un estímulo microbiano dado su empleo en la descripción original de este protocolo 3, pero los autores ciertamente alientan la prueba de otros estímulos microbianos.
- Realice el mismo procedimiento descrito anteriormente para la inyección de PBS en ratones de control.
- Monitoree a los animales después de las inyecciones para confirmar que la recuperación de la anestesia es exitosa y que los animales pueden apoyarse en la almohadilla de la pata trasera inyectada.
5. Inyecciones de CFSE
- Preparación de CFSE para inyecciones
- Descongele un vial de 5 mM de solución madre de CFSE a -80 °C. Diluya el CFSE 10 veces en PBS. Vuelva a suspender la solución completamente antes de llenar la jeringa en preparación para la inyección.
- Inyección y recuperación de CFSE
- Repita el procedimiento para anestesiar animales en la sección 3. Inyecte 20 μl de 0,5 mM de CFSE en la almohadilla del pie trasero que previamente recibió BCG o PBS.
nota: La inyección de CFSE debe realizarse el día anterior (24 horas) a la fecha prevista para el sacrificio.
>6. Extirpación quirúrgica del ganglio linfático poplíteo (pLN)
NOTA: Se recomienda el uso de instrumentos quirúrgicos esterilizados y su descontaminación repetida en etanol al 70% durante este paso.
- Sacrificar a los ratones. Rocíe al animal con etanol al 70%. Sujete al animal en posición dorsal, sobre una tabla de disección.
nota: Los autores pueden recomendar la eutanasia a través de la luxación cervical.
- Con cuidado, haga una incisión vertical en la parte trasera del muslo. Limpie el músculo y la grasa con tijeras y pinzas para exponer y, en consecuencia, extirpar el pLN ubicado en lo profundo de la bolsa de grasa, en el hueco de la rodilla.
- Transfiera el pLN a 0,5 ml de PBS estéril, en hielo.
>7. Generación de suspensión de una sola celda a partir de pLN
- Homogeneizar el pLN a través de un filtro de células de 70 micras colocado en una placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de PBS o tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (PBS que contiene 2% de suero fetal de ternero (FCS), 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 1 mM de azida sódica). Homogeneizar a través del colador utilizando el extremo posterior de una jeringa de 3 ml.
nota: La azida de sodio es tóxica y debe manipularse con precaución.
- Lave el colador con otros 5 ml de tampón PBS o FACS, recoja el material en un tubo de 15 ml y granule las células a 277 x g (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 °C. Alternativamente, homogeneice los pLN directamente en tubos de microcentrífuga utilizando homogeneizadores de polipropileno.
- Según el tamaño del pellet, vuelva a suspender la suspensión de pLN en un volumen adecuado de tampón PBS o FACS, por ejemplo, 200 - 1.000 μl. Utilice una cámara de recuento para cuantificar el número total de células obtenido de cada suspensión de LN. Use azul de tripán para excluir las células muertas o moribundas.
>8. Tinción celular y citometría de flujo
- Transfiera 1 - 10 x 106 celdas a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Lavar con tampón FACS y pellet por centrifugación a 277 x g (1.200 rpm, R= 172 mm) durante 5 min, 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 50 - 100 μl de cóctel de anticuerpos (ver Marcadores de células dendríticas [DC] utilizados para la tinción de superficies, Tabla de materiales) que contenga 0,5 - 1 μg de CD16/CD32 anti-ratón (para bloquear interacciones inespecíficas mediadas por Fc) en tampón FACS durante 30 - 45 min, en hielo. Proteja las muestras de la luz.
- Después de la incubación, lavar las celdas con tampón FACS y pellet por centrifugación a 277 x g (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 °C.
- Vuelva a suspender las células en 50 - 100 μl de tampón FACS. Adquisición de datos en un citómetro de flujo.
