Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. A. fumigatus Cultivo y condiciones
- Prepare el medio de agar mínimo de glucosa como se describe.
- Ajuste el medio a pH 6,5 utilizando hidróxido de sodio (NaOH) 1 M y autoclave a 120 °C durante 20 min.
- Dejar enfriar a 65 °C.
- Trabajando en una campana de flujo estéril, vierta 30 mL de medio enfriado en un matraz T75 y deje que se enfríe con el cuello del matraz apoyado en una pipeta de 25 mL para crear una pendiente de agar.
- Extraer la cepa dsRed Af293-Aspergillus fumigatus en el agar e incubar durante 7 días a 37 °C + 5% de dióxido de carbono (CO2). Dos matraces producirán aproximadamente 109 conidios en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la biotinilación.
>2. A. fumigatus Etiquetado y preparación
NOTA: Al realizar este ensayo por primera vez, prepare la cepa parental Af293-A. fumigatus. Tome muestras de ambas cepas en tubos de microcentrífuga y etiquete solo una de cada cepa como se describe a continuación. Esto permitirá tener conidios de control sin color y conidios con un solo color, ya sea dsRed o Alexa Fluor 633 (AF633), para probar la configuración y el equipo.
- Coseche los conidios de A. fumigatus sumergiendo el cultivo con 30 mL de PBS + 0.05% Tween-80. Filtre la suspensión resultante a través de un filtro de células de 40 μm en un tubo de 50 ml para eliminar los fragmentos de hifas.
- Centrifugar a 805 x g durante 10 min, retirar el sobrenadante y lavar una vez en 20 mL de PBS estéril. Piscina de conidios de dos placas de la misma cepa durante la etapa de lavado.
- Después de la etapa de lavado, vuelva a suspender el pellet en 5 mL de PBS y transfiera 1 mL de alícuotas de suspensión conidial a tubos de microcentrífuga. 1 mL de suspensión de cada cepa suele ser suficiente para la obtención de imágenes de células vivas. Envuelva las alícuotas restantes en papel de aluminio y guárdelas a 4 °C.
- Centrifugar las alícuotas de la suspensión conidial a 9.300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el pellet de conidiales en 1 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M (NaHCO3) pH 8,3.
- Prepare 10 mg de biotina/200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) solución madre reconstituyendo 25 mg de biotina en 500 μL de DMSO. Añadir 10 μL de solución madre de biotina/DMSO al tubo de microcentrífuga, cubrirlo con papel de aluminio e incubar durante 2 h en un balancín a 4 °C.
- Alicuente el resto de la solución madre de biotina/DMSO y congélelo a -20 °C para su uso en experimentos posteriores.
- Centrifugar durante 10 min a 9.300 x g y retirar con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de conidiales en 1 mL de 100 mM de clorhidrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl) pH 8,0 durante 1 h para desactivar la biotina que flota libremente.
- Centrifugar durante 10 min a 9.300 x g y retirar con cuidado el sobrenadante. Lave el pellet dos veces con 1 mL de PBS estéril y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS.
- Disuelva 1 mg de estreptavidina-AF633 en 0,5 ml de PBS para formar una solución madre de 2 mg/ml. Añadir 10 μL de 2 mg/mL de estreptavidina-AF633 por 1 mL de suspensión conidial e incubar durante 40 min a temperatura ambiente sobre un balancín cubierto con papel de aluminio. El resto de la estreptavidina-AF633 se puede congelar en alícuotas para su uso en experimentos posteriores.
- Centrifugar durante 10 min a 9.300 x g y retirar con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de conidios en 1 mL de PBS y cuente los conidios con un hemocitómetro con una dilución de 1:1.000 (1:100 y luego 1:10). Ajuste la concentración de conidios a 3,6 x 106/mL con medios independientes delCO2, envuélvalos en papel de aluminio y guárdelos a 4 °C.
nota: Los conidios ahora están marcados con AF633 y se denominarán conidios FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE).
- Opcional: Si se requiere estimulación con conidios inflamados, después de contar los conidios (paso 2.9), diluya los conidios a 7,2 x 106/mL en medio a base de nitrógeno de levadura (YNB) y agregue 500 μL de suspensión de conidios a 4,5 mL de medio YNB en un matraz Erlenmeyer de 50 mL esterilizado en autoclave. Cubra y coloque el matraz en una incubadora agitadora (200 rpm a 37 °C) durante 6 h.
- Transfiera el medio a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 805 x g durante 10 min a temperatura ambiente y lavar una vez en PBS. Centrifugar nuevamente y resuspender el pellet en un medio independiente de CO2 de 1 mL, dando 3.6 x 106 conidios/mL.
NOTA: Los conidios se agrupan con frecuencia después de que se hinchan, lo que dificulta el recuento preciso, se recomienda calcular con el número contado de conidios en reposo utilizados.
>3. Aislamiento de neutrófilos y monocitos humanos
- Extraiga 20 mL de sangre venosa de voluntarios sanos en dos tubos de sangre de 10 mL que contengan ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Para cada donante por separado, vierta 20 mL de sangre en un tubo de 50 mL y diluya con 15 mL de PBS.
- Cubra la sangre con 15 mL de una solución de aislamiento de linfocitos (densidad 1,077 g/mL) con una jeringa y una aguja de hierro. Coloque la aguja en la parte inferior del tubo y fuerce suavemente la solución de aislamiento de linfocitos. Centrífuga a 630 x g durante 20 min sin freno y con baja aceleración.
- Prepare PBS, enfriado en hielo.
nota: Los pasos 3.4 y 3.5 deben seguirse simultáneamente para generar monocitos (3.4) y neutrófilos (3.5).
- Con una pastette, recoja la capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Esta es la capa en el centro entre el suero amarillo (superior) y la capa transparente de solución de aislamiento de linfocitos (inferior), y se transfiere a un tubo nuevo de 50 ml.
- Llene el tubo con el PBMC hasta 50 mL con PBS frío y centrifugue a 582 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y lave dos veces con PBS frío y vuelva a suspender 1 mL de PBS por cada 20 mL de sangre del donante utilizada inicialmente.
- Realice diluciones 1:10 para el recuento añadiendo 20 μL de la suspensión celular a 160 μL de PBS y 20 μL de azul de tripán. Cuente las células con un hemocitómetro.
- Prepare una solución tampón agregando 26 mL de suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor y 2.1 mL de EDTA 0.5 M a 500 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS). Centrifugar las células durante 10 min a 515 x g y volver a suspender en 40 μL de solución tampón por 1 x 107 células.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL y agregue 10 μL de microperlas CD14 por 1 x 107 celdas, mezcle bien e incube durante 15 min a 4 °C, asegurándose de mezclar los tubos cada 5 min.
- Lave las células añadiendo 1 ml de solución tampón por 1 x 107 células y centrifugue a 515 x g durante 10 min.
- Aspirar completamente el sobrenadante y resuspender hasta 1 x 108 células en 500 μL de solución tampón.
- Coloque 1 columna por muestra en un separador magnético de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar, lavar la columna una vez con 500 μL de solución tampón.
- Pipetear los 500 μL de suspensión celular a través de la columna, esperar a que la columna se seque y luego lavar repitiendo esto tres veces con solución tampón.
- Coloque un nuevo tubo de 15 mL debajo de la columna y retire la columna del separador magnético. A continuación, enjuague las células de la columna y colóquelas en el tubo con 1 ml de solución tampón.
- Agregue 4 mL de solución tampón y centrifugue a 515 x g durante 10 min, y luego vuelva a suspender en 1 mL de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Realice diluciones 1:10 para el recuento añadiendo 20 μL de la suspensión celular a 160 μL de PBS y 20 μL de azul de tripán. Cuente las células con un hemocitómetro.
- Ajuste la concentración de células a 6 x 105/mL con RPMI y siembre 200 μL en una placa de imagen de 35 mm a base de vidrio. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
- Al día siguiente, antes de la toma de imágenes, retire el RPMI y agregue 200 μL de medio independiente de CO2.
nota: Estos monocitos también se pueden diferenciar en varios subconjuntos de macrófagos antes de la obtención de imágenes. Si esta es una técnica a explorar, un excelente punto de partida es un artículo reciente de Ohradanova-Repic et al.
- Después de recolectar la capa de PBMC, retire todo el suero y la mayor parte de la solución de aislamiento de linfocitos, pero tenga cuidado de no quitar la pequeña banda blanca en la parte superior de la bolita roja, ya que contendrá la mayoría de los neutrófilos.
- Prepare un stock tampón de lisis hipotónica 10x añadiendo 83 g de cloruro de amonio (NH4Cl) y 10 g de bicarbonato de potasio (KHCO3) en 1 L de agua estéril. Conservar a 4 °C.
- Diluya este caldo 10 veces con agua estéril y agréguelo a los tubos. Luego, invierta con cuidado 3 veces e incube en hielo durante 15 minutos.
- Centrifugar a 394 x g durante 10 min y resuspender en tampón de lisis hipotónica durante 10 min en hielo.
- Centrifugar a 394 x g y lavar dos veces con PBS frío. Vuelva a suspender en 1 mL de medio independiente de CO2 por donante.
- Realice diluciones 1:10 para el recuento añadiendo 20 μL de la suspensión celular a 160 μL de PBS y 20 μL de azul de tripán. Cuente las células con un hemocitómetro.
- Para microscopía, agregue 200 μL de la misma suspensión celular a una placa de imágenes a base de vidrio de 35 mm.
NOTA: Las imágenes de neutrófilos o citometría de flujo deben iniciarse de inmediato debido a su propensión a sufrir apoptosis si no se estimulan. Si esto no es posible, los neutrófilos deben mantenerse en hielo y usarse lo antes posible (dentro del mismo día).
>4. Microscopía de video de célula viva
>NOTA: La elección del microscopio dependerá de lo que esté disponible localmente, pero la configuración del microscopio deberá incluir una etapa invertida, una cámara ambiental calentada a 37 °C y filtros de excitación/emisión apropiados para dsRed (532/561 nm) y AF633 (633 nm). Los conidios FLARE no funcionan con el láser de 488 nm en lugar del láser de 532/561 nm para dsRed. Al realizar este experimento por primera vez, utilice los conidios de control sin color y de un solo color para probar la fluorescencia de fondo y el sangrado entre los canales dsRed y AF633.
- Encienda el calentador del microscopio antes del experimento y deje tiempo suficiente para que la cámara de control ambiental se caliente a 37 °C. El tiempo necesario para que la temperatura de la cámara se estabilice variará para las diferentes configuraciones de microscopio.
- Encienda el microscopio y la computadora, y cargue el software de imágenes. Monte la antena parabólica de imágenes en la platina del microscopio y ajuste el enfoque para encontrar los neutrófilos o monocitos humanos.
- Para dsRed y AF633, ajuste la potencia del láser al 10% y el tiempo de exposición a 1 s en los ajustes de adquisición.
- Retire el portaobjetos de imagen y añada 100 μL de suspensión conidial FLARE de 3 x 106/mL a los pocillos apropiados (volumen total 300 μL/pocillo). Registre el momento en que se agregan los conidios FLARE al plato.
- Vuelva a colocar la diapositiva en el escenario y ajuste la sensibilidad de la cámara para dsRed y AF633 para ver claramente los conidios, pero sin sobreexponer la imagen. Configure una lista de puntos de etapa si se requiere la adquisición de varios puntos.
- Comience la obtención de imágenes cuando todos los puntos estén enfocados, los canales estén optimizados y se hayan establecido el tiempo y la duración del ciclo. El tiempo del ciclo y la duración de la toma de imágenes dependen de la pregunta experimental. El objetivo es mantener el tiempo de ciclo lo más corto posible (≤2 min) con 1 min, lo que permite un análisis en profundidad de la dinámica de absorción.
