Evaluación en tiempo real de la actividad antifúngica de las células inmunitarias humanas primarias

Resumen

Fuente: Brunel, S. F. et al., Imágenes en vivo de la actividad antifúngica de neutrófilos primarios humanos y monocitos en respuesta a A. fumigatus.J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra imágenes de células vivas para el análisis de la actividad antifúngica en neutrófilos humanos utilizando conidios fluorescentes reporteros de Aspergillus. Inicialmente, tanto la fluorescencia roja como la magenta se detectan dentro de los neutrófilos, mientras que la fluorescencia roja disminuye con el tiempo, lo que indica la degradación de los conidios y confirma la actividad antifúngica de los neutrófilos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. A. fumigatus Cultivo y condiciones

1. Prepare el medio de agar mínimo de glucosa como se describe.
   1. Ajuste el medio a pH 6,5 utilizando hidróxido de sodio (NaOH) 1 M y autoclave a 120 °C durante 20 min.
   2. Dejar enfriar a 65 °C.
   3. Trabajando en una campana de flujo estéril, vierta 30 mL de medio enfriado en un matra....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
glicerol	sigma	G6279	http://www.sigmaaldrich.com
Matraz T75	Greiner Bio-One	658 175	http://www.greinerbioone.com/
Pbs	Gibco	20012-019	https://www.thermofisher.com/
Preadolescente-80	Fisher Científico	10592955	https://nl.fishersci.com/
Filtro de 40 μm	Thermo Fisher Scientific	22363547	https://www.thermofisher.com/
Tubo Falcon de 15 ml	Greiner Bio-One	188 261	http://www.greinerbioone.com/
Tubo Falcon de 50 ml	Greiner Bio-One	227 261	http://www.greinerbioone.com/
MilliQ	Millipore	QGARD00R1	El agua nanopura funciona de manera similar. http://www.merckmillipore.com/
biotina	Sondas moleculares	B-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Dmso	sigma	D5879	http://www.sigmaaldrich.com
Estreptavidina-AF633	Sondas moleculares	S-21375	AF633 es el único fluoróforo probado hasta ahora que permanece visible en los fagosomas. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Tubos sanguíneos de EDTA	Greiner Bio-One	455036	Cualquier tubo de sangre con un agente anticoagulante debería funcionar. http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus	GE Cuidado de la Salud	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
Azul de tripano	Thermo Fisher Scientific	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSS	Gibco	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
Microperlas CD14	Myltenyi Biotec	130-050-201	También se pueden utilizar otros métodos de aislamiento de monocitos, preferimos este método, ya que proporciona una alta pureza constante de monocitos sin ser laborioso. http://www.miltenyibiotec.com/en/
Columnas MS	Myltenyi Biotec	130-042-201	Ver comentario en CD14 microperlas. http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + Glutamax	Gibco	72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
Medio independiente del CO2	Thermo Fisher Scientific	18045054	Necesario si no hay suficiente intercambio de CO2 durante la toma de imágenes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home
μ corredera de 8 pocillos con fondo de vidrio	Ibidi	80827	Este es el plato de imágenes que usamos, sin embargo, cualquier plato de imágenes de vidrio del tamaño adecuado debería funcionar. http://ibidi.com/
Sistema de adquisición de imágenes de células vivas UltraVIEW VoX 3D	Perkin Elmer	L7267000	Incluye software de volocity para adquisición y análisis. http://www.perkinelmer.com/