Utilización de bicapas lipídicas soportadas por perlas para investigar la salida sináptica de las células T

Resumen

Fuente: Céspedes, P. F., et al. Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la salida de partículas de las sinapsis inmunitarias de células T. J. Vis. Exp. (2022)

Este video ilustra la reconstitución de células presentadoras de antígenos sintéticos a través de bicapas lipídicas soportadas por perlas y su aplicación en la evaluación de la salida sináptica generada por las células T activadas.

Protocolo

1. Calibraciones de densidad de proteínas en BSLBs (bicapas lipídicas soportadas por perlas)

1. Antes de tomar las perlas de sílice no funcionalizada de 5,00 ±0,05 μm de diámetro, mezcle bien la solución madre y vuelva a suspender los grandes grumos de perlas sedimentadas en el fondo de los matraces><. NOTA: Las perlas de sílice tienden a sedimentarse rápidamente, lo que puede provocar errores de conteo. Mezcle enérgicamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen máximo de una micropipeta P1000.
2. Diluir 1 μL de solución de perlas en 1.000 μL de PBS, contar las perlas utilizando una cámara de hemocitómetro y calcular su concentración por mL.
   nota: La tinción con azul de tripano no es necesaria para visualizar las perlas de sílice.
3. Calcule el volumen de perlas de sílice necesarias para 5 × 10⁵ BSLB finales por punto de la valoración.
4. Transfiera el volumen requerido de perlas de sílice a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
5. Lave las perlas de sílice tres veces con 1 mL de PBS estéril y centrifugue las perlas durante 15 s en una microcentrífuga de sobremesa a RT (a rpm fijas).
   NOTA: Al retirar la solución de lavado, evite alterar el pellet de perla. Una pequeña columna tampón no afectará a la propagación de los liposomas que componen la mezcla maestra de liposomas, ya que estos también se encuentran en PBS.
6. Prepare tres volúmenes de la mezcla maestra de liposomas para ensamblar el BSLB en las perlas de sílice lavadas (por ejemplo, si el volumen total inicial de perlas de sílice es de 20 μL, prepare un mínimo de 60 μL de la mezcla maestra de liposomas).
7. Para las valoraciones de biotinyl cap PE mol%
   1. Prepare las mezclas maestras de lípidos que contengan diluciones 5 veces mayores de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluir el 0,4 mM de Biotinyl Cap PE mol% en una matriz 100% DOPC.
      2. Mezcle cada punto de valoración de % molar de Biotinyl Cap PE en una proporción de 1:1 (vol: vol) con una solución de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de modo que un 12,5% mol final de lípidos que contienen Ni esté presente en todas las valoraciones.
         nota: El 12,5 % molar (vol:vol%) de los lípidos que contienen Ni representa la composición lipídica mixta de los BSLB en los que también se pueden probar proteínas marcadas con His en calibraciones paralelas. Por ejemplo, dado que todas las cepas de liposomas se preparan a la misma concentración molar, para alcanzar la mezcla objetivo de % molar en 200 μL de mezcla final de liposomas, simplemente mezcle 100 μL de 25% molar de DGS-NTA que contiene Ni con 100 μL de DOPC al 100% molar.
   2. Transfiera 5 × 10⁵ perlas de sílice lavadas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, de modo que se ensamble un punto de valoración de % molar de Biotinyl Cap PE por tubo.
   3. Agregue las mezclas maestras de valoración de Biotinyl Cap PE mol% a las perlas de sílice lavadas y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso destruyen la bicapa lipídica.
   4. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB que se están formando ahora para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
   5. Añada argón a las existencias de 0,4 mM de lípidos antes del almacenamiento y manipule utilizando una técnica estéril.
      nota: Conecte un tubo pequeño al cilindro de gas argón/nitrógeno. Antes de agregar gas a los tubos, ajuste el regulador del cilindro de gas para que la presión no supere los 2 psi. Conecte una punta de pipeta estéril al tubo de salida para dirigir el flujo de gas dentro del caldo de liposomas durante 5 segundos y cierre rápidamente la tapa. En el caso de caldos lipídicos, selle la tapa del tubo con una película de parafina antes de almacenarlo a 4 °C.
   6. Mueva los BSLB a un mezclador de laboratorio vertical de ángulo variable (consulte la Tabla de materiales) y mezcle durante 30 minutos en RT utilizando una mezcla orbital de 10 rpm.
      nota: Este paso evitará la sedimentación de las perlas durante la formación de la bicapa lipídica soportada.
   7. Gire las perlas centrifugando durante 15 s a RT en una minicentrífuga de sobremesa y, a continuación, lave tres veces con 1 mL de HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
   8. Bloquee los BSLB formados agregando 1 mL de caseína al 5% o BSA al 5% que contenga 100 μM de NiSO₄ para saturar los sitios NTA y 200 nM de estreptavidina para recubrir uniformemente todos los sitios de anclaje de biotina en los BSLB. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total e incube en el mezclador vertical durante no más de 20 minutos a RT y 10 rpm.
   9. Gire las BSLB centrifugando durante 15 s a RT en una minicentrífuga de sobremesa y luego lave tres veces con 1 mL de tampón HBS/HSA (BSA).
      nota: Mantenga las perlas lavadas verticalmente con un pequeño volumen de tampón de lavado que cubra los BSLB. Evite la deshidratación de los BSLB ya que el aire destruirá la bicapa lipídica.
8. Para la valoración de proteínas marcadas con His en un 12,5 % molar de BSLB que contienen DGS-(Ni) NTA
   1. Prepare tres volúmenes de mezcla maestra de liposomas que contengan un 12,5 % molar final de DGS-NTA(Ni).
   2. Utilice la mezcla maestra de liposomas para volver a suspender las perlas de sílice lavadas y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso dañan la bicapa lipídica.
   3. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB que se están formando ahora para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
   4. Añada argón a las existencias de lípidos de 0,4 mM antes del almacenamiento y manipule utilizando una técnica estéril.
   5. Mueva los BSLB al mezclador vertical y mezcle durante 30 minutos a RT utilizando la mezcla orbital a 10 rpm.
   6. Gire las perlas centrifugando durante 15 s a RT en una minicentrífuga de sobremesa y, a continuación, lave tres veces con 1 mL de HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
   7. Bloquee los BSLB formados agregando 1 mL de caseína al 5% (o 5% de BSA) que contenga 100 μM de NiSO4 para saturar los sitios NTA en los BSLB. Mezcle suavemente e incube en el mezclador vertical durante no más de 20 minutos a RT y 10 rpm.
   8. Lave tres veces con HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de solución de bloqueo.
   9. En una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U, prepare diluciones en serie de 2 veces de las proteínas.
      1. Prepare una concentración inicial de 100 nM para la proteína de interés en un volumen total de 200 μL de tampón HBS/HSA (BSA), distribuya 100 μL de esta solución en la primera columna y los 100 μL restantes en la parte superior de la columna #2 que contenga 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
      2. Continúe transfiriendo en serie 100 μL de la columna #2 a la columna #3 y repita según sea necesario para cubrir todos los puntos de valoración. Deje la última columna de la serie sin proteína, ya que se utilizará como referencia en blanco para la cuantificación.
   10. Vuelva a suspender las BSLB preparadas en un volumen tal que 5 × 10⁵ BSLB estén contenidas en 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
   11. Transfiera 100 μL de la suspensión BSLB a los pocillos de una segunda placa de 96 pocillos con fondo en U, de modo que cada pocillo reciba 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Gire la segunda placa que contiene BSLB durante 2 minutos a 300 × g y RT y deseche el sobrenadante.
   13. Transfiera los volúmenes de 100 μL de la placa de valoración de proteínas a la placa que contiene los BSLB sedimentados. Mezcle suavemente, evite la generación excesiva de burbujas durante el pipeteo e incube durante 30 min a RT y 1.000 rpm con un agitador de placas. Protéjalo de la luz con papel de aluminio.
   14. Lave la placa tres veces con tampón HBS/HSA (BSA) utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
   15. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración está directamente conjugada con fluorocromos y tiene valores F/P conocidos.
   16. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración no está etiquetada o conjugada con fluorocromos o no se dispone de un estándar de perlas MESF, utilice anticuerpos conjugados Alexa Fluor 488 o 647 con valores F/P conocidos para teñir el BSLB recubierto de proteína.
   17. Tinción con concentraciones saturantes de anticuerpos de cuantificación.
       NOTA: Dependiendo del nivel de expresión objetivo, estos oscilan entre 5 y 10 μg/mL.
   18. Teñir durante 30 min a RT y 1.000 rpm con un agitador de placas. Protéjalo de la luz con papel de aluminio.
   19. Lavar dos veces con tampón HBS/HSA (BSA) y una vez con PBS utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
       nota: Utilice PBS, pH 7.4 para resuspender los BSLB lavados antes de la adquisición. No utilice tampones que contengan proteínas, ya que esto conduce a la formación de burbujas durante la mezcla automática de muestras con muestreadores de alto rendimiento.
   20. Adquiera los estándares MESF, asegurándose de que los picos más brillantes permanezcan en el rango de detección lineal para el detector de cuantificación (canal), como se muestra en la Figura 1B (vii).
   21. Adquiera las muestras manualmente o utilizando HTS. Si utiliza este último, vuelva a suspender las BSLB en 100 μL de PBS y adquiera 80 μL utilizando un caudal entre 2,5 y 3,0 μL/s, un volumen de mezcla de 100 μL (o el 50% del volumen total si el volumen de resuspensión es menor), una velocidad de mezcla de 150 μL/s y cinco mezclas para garantizar que las BSLB sean monodispersas.
   22. Exporte los archivos FCS.
   23. Concéntrese en eventos individuales para los análisis (Figura 2A), ya que los dobletes o tripletes introducirán errores en la determinación. Utilice la identificación anidada de eventos individuales como se indica en el paso 1.2.3 del protocolo.
   24. Mida el MFI de cada fracción de MESF (1-4) y reste el MFI de las cuentas en blanco para extraer los MFI corregidos (cMFI).
   25. Realice un análisis de regresión lineal para extraer la pendiente (b) de MESF sobre el cMFI calculado para los estándares MESF.
   26. Extraiga el MFI de cada punto de valoración y reste el MFI de las perlas sin proteína para obtener cMFI.
   27. Divida los cMFI con la pendiente calculada para extraer el MESF enlazado a los BSLB para cada punto de valoración.
   28. Divida el MESF unido a BSLB por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación para extraer el número medio de moléculas unidas por BSLB.
   29. Utilizando el diámetro de los BSLB (5,00 ± 0,05 μm), extraiga el área de la superficie del cordón (SA = 4pr2) para calcular las densidades finales de proteína (mole/μm²) por punto de valoración (concentración de proteína).
   30. Realice un nuevo análisis de regresión de la concentración de proteínas sobre la densidad de proteínas para calcular la pendiente (b) de la línea de mejor ajuste.
       nota: La concentración del 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confiere una capacidad máxima de anclaje de aproximadamente 10.000 molec./μm2 10 sin inducir la activación inespecífica de los linfocitos T ni afectar a la movilidad lateral de los SLB.

>2. Realización de experimentos de transferencia sináptica entre linfocitos T y BSLB

1. Antes de ejecutar el experimento de transferencia sináptica
   1. Adquiera BSLB no fluorescentes, BSLB con lípidos fluorescentes, células no teñidas (o perlas de compensación; consulte la Tabla de materiales) y celdas teñidas de un solo color (o perlas de compensación) para identificar las interacciones del espectro de fluorescencia del instrumento. Concéntrese en aquellos detectores con una alta dispersión de desbordamiento para rediseñar el panel policromático, aumentar la sensibilidad y reducir el error de medición en detectores críticos.
   2. Valore los anticuerpos de detección para encontrar la concentración óptima, lo que permite la detección de eventos positivos sin comprometer la detección de negativos.
      nota: Repita este paso cada vez que haya un cambio en el lote de anticuerpos, ya que los valores de F/P y el brillo varían de un lote a otro.
   3. Opcional: Optimice los voltajes PMT adquiriendo la muestra en diferentes rangos de voltaje (es decir, un voltaje camina) para encontrar los PMT que conducen a una señal óptima sobre el ruido (es decir, la separación de negativos y positivos mientras se garantiza que la señal de la población más brillante permanezca en el rango lineal).
2. Medición de la transferencia de salida de la célula T a BSLB
   1. Prepare RPMI 1640 suplementado (en adelante medio R10) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Utilice el medio R10 para cultivar y expandir las células T.
   2. El día 1, aísle las células T de las cámaras de sangre periférica o del sistema de leucorreducción (LRS). Utilice kits de aislamiento y separación de células de inmunodensidad (consulte la Tabla de materiales) para el enriquecimiento de las células T CD4+ y CD8+ humanas.
   3. Siembre las células a una concentración final que oscile entre 1,5 y 2,0 × 10⁶ células/mL, utilizando placas de 6 pocillos con un total de no más de 5 mL por pocillo.
   4. Active las células T utilizando una proporción de 1:1 de perlas magnéticas de activación de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) (consulte la Tabla de materiales) y agregue 100 UI de IL-2 humana recombinante para apoyar la proliferación y la supervivencia de las células.
   5. El día 3, retire las perlas magnéticas activadoras usando columnas magnéticas (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que las perlas magnéticas permanezcan adheridas a los lados del tubo antes de recuperar las celdas para pasos de lavado adicionales.
   6. Lave las perlas magnéticas una vez más con 5 mL de medio R10 fresco, mezcle bien y vuelva a colocarlas en el imán. Recupera este volumen y mézclalo con las celdas recuperadas en el paso 1.2.5.
   7. Vuelva a suspender las células a 1,5-2 × 10⁶ células/mL en R10 fresco que contenga 100 U/mL de IL-2. Reponer el medio después de 48 h, asegurándose de que la última adición de IL-2 sea 48 h antes del día de experimentación (días 7 a 14 de cultivo).
   8. El día del experimento de transferencia sináptica, prepare el medio de ensayo de transferencia sináptica suplementando el medio RPMI 1640 sin rojo de fenol con 10% de FBS, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. No incluya IL-2 humana recombinante.
   9. Cuente las células utilizando tinción con azul de tripán o exclusión de corriente eléctrica y vuelva a suspenderlas hasta una concentración final de 2,5 × 10⁶ células/ml en el medio. Si se observa una muerte celular excesiva (>10%), elimine las células muertas o moribundas utilizando una mezcla de polisacárido y diatrizato de sodio (consulte la Tabla de materiales) de la siguiente manera:
      1. Capa de 15 mL de cultivo celular encima de 13 mL de la solución de polisacárido-diatrizato de sodio.
      2. Centrífuga de 1.250 × g durante 20 min a RT con aceleración y desaceleración mínimas. Recoja la capa celular (nube) en la interfaz entre el medio y la solución de polisacárido-diatrizato de sodio.
      3. Lave las células al menos dos veces con un medio de ensayo de transferencia sináptica precalentado (preparado en el paso 1.2.7).
      4. Cuente y resuspenda las células hasta una concentración final de 2,5 × 10⁶/mL utilizando un medio de ensayo de transferencia sináptica. Cocultivo de 100 μL de esta suspensión celular con BSLBs (ver paso 1.2.15).
   10. Calcule el número de BSLB necesarios para el experimento; considere todas las diferentes mezclas maestras de proteínas y titulaciones de antígenos que se van a probar (ya sean monómeros de péptidos HLA/MHC biotinilados o Fab anti-CD3ε monobiotinilados).
   11. Ensamble los BSLB siguiendo los mismos pasos de la sección 5 del protocolo, pero esta vez, combine todas las titulaciones de proteínas y lípidos necesarias para reconstituir una membrana APC compleja (Figura 3A). Mantenga las mismas relaciones vol.-vol entre el volumen inicial de las perlas de sílice y el volumen de la mezcla de proteínas utilizado durante las calibraciones, así como los tiempos y temperaturas utilizados en la carga de BSLB. Por ejemplo, si se utilizaron 0,5 μL de perlas de sílice/pocillo y 100 μL/pocillo de mezcla de proteínas para la calibración inicial, mantenga proporciones de 5:1.000 vol:vol para preparar las BSLB que se van a cocultivar con células T.
   12. Una vez que las BSLB se hayan cargado con la mezcla de proteínas de interés, lávelas dos veces con HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de proteínas no unidas. Utilice velocidades de sedimentación de 300 × g durante 2 min en RT en cada paso de lavado y deseche los sobrenadantes.
   13. Vuelva a suspender los 5 × 105 BSLB por pocillo en 200 μL.
   14. Transfiera 100 μL por pocillo a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U para hacer un duplicado, de modo que la cantidad final de BSLB por pocillo sea de 2,5 × 10⁵.
   15. Gire los BSLB a 300 × g durante 2 min y RT y deseche el sobrenadante.
   16. Vuelva a suspender las BSLB con 100 μL de suspensión de células T; mezcle suavemente para evitar la formación de burbujas.
   17. Incubar los cocultivos durante 90 min a 37 °C.
       nota: Alternativamente, las células y las perlas se pueden resuspender en tampón HBS/HSA (BSA) en lugar de RPMI libre de fenol-rojo para el cocultivo. En este caso, la incubación debe realizarse en una incubadora sin CO₂, ya que este gas acidificará rápidamente el tampón en ausencia de bicarbonato.
   18. Enfríe los cocultivos de células BSLB-T incubando primero las células en RT durante un mínimo de 15 min. Protéjalas de la luz.
   19. Centrifugar las células durante 5 min a 500 × g y RT; desechar el sobrenadante.
   20. Vuelva a suspender las células en RT 2% BSA-PBS (libre de Ca₂⁺ y Mg₂⁺) para el bloqueo. Coloque las celdas en hielo durante 45 min. Protégete de la luz.
   21. Durante la incubación de las células, prepare la mezcla maestra de anticuerpos utilizando BSA al 2% filtrado a partir de 0,22 μm en PBS como tampón de tinción, lo que proporcionará un bloqueo adicional
       nota: Algunos lotes de anticuerpos conjugados con colorantes violeta brillante tienden a unirse a los BSLB de forma inespecífica. El bloqueo con 5% de BSA-PBS ayuda a reducir este ruido. A partir de ahora, asegúrese de mantener la cadena de frío intacta.
   22. Centrifugar los cocultivos a 500 × g durante 5 min y 4 °C. Antes de desechar los sobrenadantes, asegúrese brevemente de que el pellet esté presente inspeccionando el fondo de la placa de 96 pocillos con una luz de fondo.
   23. Con una pipeta multicanal, vuelva a suspender las células en la mezcla maestra de tinción que contiene concentraciones optimizadas de anticuerpos.
       nota: Utilice puntas de pipeta sin filtro para evitar la generación de burbujas y errores en la distribución de los volúmenes de tinción.
   24. Incluya células marcadas con isotipo y BSLB, BSLB fluorescentes y no fluorescentes, y células y BSLB teñidas solas. Respete el número total de eventos por pocillo para todos los controles (es decir, solo los BSLB que contienen 5 × 10⁵ BSLB/pocillo, y solo los controles de celdas que contienen 5 × 10⁵ células/pocillo para evitar un aumento relativo de anticuerpos por evento teñido).
   25. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen e incubar durante 30 minutos en hielo. Protégete de la luz.
   26. Lave las células y los BSLB dos veces con BSA-PBS al 2% helado, pH 7,4 y pasos de sedimentación de 500 × g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender los cocultivos lavados en 100 μL de PBS y adquiera inmediatamente.
   27. Si se necesita fijación, fije con 0.5% p/v de PFA en PBS durante 10 min, lávese una vez y manténgalo en PBS hasta la adquisición. Protégete de la luz.
   28. Antes de la compensación, adquiera los estándares MESF, asegurándose de que tanto las poblaciones más tenues como las más brillantes se encuentren en el rango lineal de medición.
   29. Adquiera muestras de compensación, calcule la compensación y aplique la matriz de compensación (enlace) al experimento.
   30. Adquirir y guardar un mínimo de 2 × 10⁴ estándares MESF totales para cada uno de los canales de cuantificación.
   31. Para la adquisición con muestreadores de alto rendimiento, ajuste la adquisición de instrumentos a estándar, ajuste la adquisición de muestras a 80 μL (o el 80% del volumen total), el caudal de la muestra entre 2,0 y 3,0 μL/s, el volumen de mezcla de la muestra de 50 μL (o el 50% del volumen total para evitar la formación de burbujas durante la mezcla), la mezcla de la muestra de 150 μL/s, y mezclando por pozo entre 3 y 5.
   32. Adquiera un mínimo de 1 × 10⁴ BSLB individuales por muestra (consulte los paneles (i)-(vi) de la Figura 3B para conocer la estrategia de compuerta de referencia).
   33. Lave el citómetro en funcionamiento durante 5 minutos con una solución de limpieza seguida de 5 minutos con agua ultrapura antes de apagar el instrumento. Si utiliza el HTS, siga las opciones de la pestaña HTS y la opción Limpiar.
   34. Exportar archivos FCS.

>3. Medición de la transferencia sináptica de partículas a BSLBs

1. Abra los archivos FCS del experimento. Seleccione la población de celdas y BSLB en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y frontal (SSC-A frente a FSC-A), como se muestra en la Figura 3B (i).
2. Seleccione los eventos dentro de la ventana de adquisición continua (Figura 3B (ii)).
3. Concéntrese en los eventos individuales de ambas células y BSLB; identifique primero las células individuales en función de la W baja en las puertas secuenciales FSC-W/FSC-H (singletes-1, panel de la Figura 3B (iii)) y SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 3B panel (iv)). Defina una puerta singlets-3 adicional seleccionando eventos con FSC-A y FSC-H proporcionales (Figura 3B, panel (v)).
4. Extraiga el MFI de las fracciones MESF en blanco y de 1 a 4 y de células individuales y MESF para cada muestra de experimento.
5. Genere valores de MFI corregidos (cMFI) para las fracciones 1 a 4 de MESF restando el MFI de la población de cuentas en blanco de cada fracción.
6. Genere cMFI para BSLB y celdas individuales (consulte el panel (i) de la Figura 3C).
7. Utilice la señal de BSLB teñida con anticuerpos de control de isotipo para corregir el MFI de BSLB teñido con anticuerpos contra los marcadores de células T relevantes. Utilice cMFI para calcular el porcentaje de transferencia sináptica normalizado (NST%) utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C.
8. Si está interesado en las partículas transferidas específicamente en respuesta a la activación de TCR, reste la señal de los BSLB nulos del MFI de los BSLB agonísticos. Utilice este cMFI para calcular el NST impulsado por el TCR utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C.
9. Si está interesado en determinar el número total de moléculas transferidas como carga de partículas a través de la interfaz de células T-BSLB, adquiera cuentas de referencia MESF utilizando la misma configuración de instrumento y sesión de adquisición para los cocultivos de células T-BSLB.
10. Analice las poblaciones de cuentas MESF y extraiga sus cMFI. Calcule la pendiente de la línea de mejor ajuste para el análisis de regresión de MESF sobre cMFI.
11. Utilice la pendiente calculada para extraer el número de MESF depositados en las BSLB. Utilice las cMFI calculadas utilizando controles de isotipo o BSLB nulas como espacios en blanco para extraer el número de MESF transferidos específicamente a las BSLB estimulantes.
12. Calcule el número de moléculas de marcadores transferidos a los BSLB dividiendo los MESF calculados (promedio) por BSLB por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación.

Resultados

Figura 1: Cuantificación absoluta de proteínas en la superficie de APCs. (A) Ejemplo de mediciones cuantitativas de citometría de flujo de ICAM-1 en la superficie de células B amigdalinas (Foll. Bc) y linfocitos T auxiliares (TFH). (I-VII) Estrategia de compuerta para analizar CXCR5+ Bc y TFH aislados de amígdalas palatinas humanas. Se muestra la estrategia de compue...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de células de 96 pocillos con fondo en U con tapa, cultivo de tejidos tratado, no pirogénico	Coprotagonista®	3799	Para la tinción de FCM y el cocultivo de BSLB y células.
Placa de cultivo de células de 96 pocillos con fondo en V con tapa, cultivo de tejidos tratado, no pirogénico.	Coprotagonista®	3894	Para la tinción de FCM de células o perlas en suspensión.
Alexa Fluor 488 NHS Éster (éster de succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Éster (éster de succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 y A20006
Multipocillo 6 pocillos Cultivo de tejidos tratados con plasma de gas al vacío	halcón	353046	Para el cultivo y la expansión de células T CD4+ y CD8+ purificadas.
Caseína de leche bovina, adecuada como sustrato para la proteína quinasa (después de la desfosforilación), polvo purificado
Dynabeads Activador T Humano CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Para la extracción de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 2 mL
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Para la extracción de Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 en volúmenes inferiores a 15 mL
Suero Fetal Bovino Calificado, Un Sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Necesita inactivación de calor durante 30 min a 56 oC
antihumano CD154 (CD40L), clon 24-31	BioLeyenda	310815 y 310818	Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 conjugados, respectivamente
Hámster Armenio IgG Alexa Fluor 647 Control de isotipo, clon HTK888	BioLeyenda	400902	Etiquetado internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Configuración del citómetro BD y perlas de seguimiento	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Seguimiento del rendimiento de los instrumentos antes del FCM cuantitativo